收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

禽腺病毒载体的构建及其生物学特性的研究

何秀苗  
【摘要】:根据群特异性抗原的不同,禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAV)属可分为3群:Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群,其中Ⅰ群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅及其它禽类分离获得的腺病毒。尽管Ⅰ群禽腺病毒的病原性大多尚未确定,但是往往与其他病原感染后的继发感染密切相关。在免疫学上,Ⅰ群禽腺病毒能诱导感染鸡产生高水平的中和性循环抗体;即使在高水平循环抗体存在的背景下,宿主仍然可受到病毒的再次感染,病毒在局部黏膜系统长期复制并且持续排毒。因此,Ⅰ群禽腺病毒有望作为良好的、可持续复制的活病毒载体侯选病毒。国外在Ⅰ群禽腺病毒载体方面已有初步的研究,但离临床应用还有很大的距离,国内在这方面的研究几乎是个空白。 人腺病毒载体研究较多,其基因组的E1、E3区和E4区上游是腺病毒最常用的外源基因插入位点。但是,由于FAV与人腺病毒的基因组结构有差异,与人腺病毒E1、E3区和E4区相应的位点在FAV基因组的定位还未清楚,因此复制非必需片段的筛选策略对于将禽腺病毒构建成病毒活载体至关重要。本研究从健康鸡群中分离出一株Ⅰ群禽腺病毒,并对其复制非必需片段进行了鉴定;对表达增强型绿色荧光蛋白eGFP的重组病毒的致病性进行了初步的研究,探讨了该毒株作为外源基因表达性载体的可行性,同时将新城疫病毒等重要病原的保护性抗原基因插入载体并获得了表达。 一、Ⅰ群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定 通过形态学、病毒特性、致细胞病变和序列比较等方法对从健康鸡群中分离出的一株疑为Ⅰ群禽腺病毒FAVI-JS进行了鉴定。试验结果表明:该病毒为球形、无囊膜,直径为70~80nm;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力,但可以凝集大鼠红细胞;在鸡胚肾细胞(CEK)上可致细胞变圆,折光性增强等病变;通过PCR方法扩增并测定了FAVI-JS株的L、R、ITR三个片段,经过与同属血清Ⅰ型的CELO病毒、FAV-1、FAV-A和血清8型的禽腺病毒(FAV-8)基因组的相应序列比较,发现,FAVI-JS与Ⅰ群禽腺病毒各毒株在上述三个片段上同源性都很高,其中与血清1型的同源性高达96%以上。根据对腺病毒分类具有重要意义的ITR序列所绘制的遗传进化树,FAVI-JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支,而与Ⅰ群禽腺病毒,特别是与血清Ⅰ型的禽腺病毒更接近。这些结果证明,FAVI-JS确为Ⅰ群禽腺病毒。 二《X)四年扬州大学博士学位论文 二、禽腺病毒江苏株(FAVI一S)复制非必需片段的确定 利用PCR方法从上述I群禽腺病毒FAVI一Js分离株中扩增出其基因组的两侧 末端片段:左侧末端片段(L片段)、右侧次末端片段(R片段)、以及右侧末端的 ITR片段,然后将L片段、R片段和ITR片段同时以串联子形式克隆进粘粒载体 pHC中,获得重组质粒pHC一FAvl一R一I双一L,再在该克隆的R片段和ITR片段之间 插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因,获得转移质粒载体PFAVI.eGFP。将 pFAVI一eGFP转染己被野生型(wt)FAVI一Js分离株感染的鸡胚肾细胞进行同源重 组,通过有限稀释法筛选重组病毒,并通过病毒蚀斑技术纯化重组病毒,结果获 得了表达增强型绿色荧光蛋白的重组I群禽腺病毒r孙汉I一eGFP,证明位于基因组 右末端R片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区。 对rFAVI一eGFP的特性进行研究发现,重组病毒r侧汉I一eGFP具有凝集大鼠红 细胞的特性,在形态上与野生病毒FAVI一JS没有区别;r称戊I一GFP在CEK上盲传 20代后,其荧光强度与初代没有显著差别,通过病毒蚀斑试验,也没有发现野生 病毒斑的形成:此外,r凡份I一eGFP在CEK上的生长曲线与野生病毒FAVI一Js基本 相似;这些结果证实,该重组病毒是稳定遗传的,具有野生病毒的特性。此外, r砂印I一eGFP可以通过鸡胚进行大量繁殖,而且尿囊腔途径比绒毛尿囊膜途径的病 毒滴度高。这些结果为禽腺病毒重组基因工程疫苗的研究奠定了基础。 三、表达增强型绿色荧光蛋白重组禽腺病毒的复制性及其致病性初步 研究 本研究进一步对重组病毒rFAVI一eGFP的体内复制情况和对SPF鸡的致病性进 行了初步的探讨。在第一批试验中,用IOSTclDS。的病毒剂量、以皮下接种途径将 FAVI一JS和:FAVI一eGFP分别感染1日龄和10日龄SPF鸡,通过IFA方法和ELISA 方法检测接种鸡体内的抗体水平的差异。结果表明,rFAVI一eGFP组的抗体水平与 FAVI一JS组相当,rFAVI一eGFP组和FAVI一Js组无论是在1日龄接种还是10日龄接 种,抗体在机体内的维持时间均较长:在1日龄组,FAVI一Js于接种后81天ELISA 检测的P入值大于7,rFAVI一eGFP于接种后62天ELisA检测的P入值大于5;在 10日龄组,两者在接种后74天ELISA检测的P加值大于6以上。在检测中发现, EUSA的敏感性比IEA高。第二批试验通过肌肉和口服两种途径,分别以105、1 09、 10’“个TCIDS。剂量的亦AvLeGFP接种10日龄sPF雏鸡,通过病毒分离方法检测 泄殖腔排毒情况,同时以正A方法和EUSA方法检测接种鸡体内的抗体水平及其 动态。结果显示,SPF鸡于接种后第七天即可检测到泄殖腔排毒和正A及ELisA 反应阳性抗体;抗体在接种后8周仍维持较高水平,其EUSA检测的P加值大于 7以上。体外中和试验表明,机体内产生的抗体对r曰戊I一eGFP具有中和效应。从


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 黄荣生;;由腺病毒感染所引起的鸡病[J];当代畜牧;1986年04期
2 李梅,李永明,吴彤,周碧君;禽腺病毒细胞病变观察和半数组织感染量测定[J];山地农业生物学报;1997年01期
3 石火英,朱国强,王永坤;禽腺病毒人工感染产蛋鸡生殖器官的超微结构观察[J];中国禽业导刊;1995年06期
4 吴彤,韩丽珍,周碧君,李永明;禽腺病毒贵州分离株HS-1的核酸酶切分析与蛋白抗原鉴定[J];中国兽医杂志;2001年01期
5 姚仕华,杨亚芬;DEAE52离子交换层析法提纯禽腺病毒的效果观察[J];贵州畜牧兽医;2004年03期
6 智海东;王云峰;解生亮;杨金雨;陈洪岩;;禽腺病毒感染及其诊断[J];畜牧兽医科技信息;2010年06期
7 曹卫云;;鸡禽腺病毒Ⅰ群感染的诊断[J];畜牧与饲料科学;2009年Z2期
8 张中秋;肖彧芳;李启红;;禽腺病毒琼扩抗原制备方法的研究[J];中国预防兽医学报;1988年03期
9 王虹,王洪斌;用日龄雏鸡卵黄液代替血清检测禽腺病毒母源沉淀抗体的比较试验[J];中国动物检疫;1993年04期
10 智海东;解生亮;杨志;王云峰;张宇辉;王牟平;孙建宏;陈洪岩;;禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原的研制及应用[J];中国兽医科学;2009年08期
11 张明明;秦爱建;庄骁颖;王小辉;;CAG和MLP启动子控制的重组禽腺病毒构建[J];畜牧与兽医;2010年03期
12 李俊宝;;禽腺病毒引起的疾病(综述)[J];中国家禽;1981年04期
13 李富强;禽腺病毒鸽分离株在鸡胚原代细胞上的生长特性和血清学特征[J];国外畜牧科技;1998年06期
14 邱昌庆;从传染性心包积水病例分离出禽腺病毒[J];畜牧兽医科技信息;2000年01期
15 何秀苗;官丁明;禤金彩;韦平;;传染性腔上囊病病毒与禽腺病毒混合感染的分子鉴定[J];中国兽医科学;2009年03期
16 孙锦;李秋艳;李云龙;黄兵;宋敏训;李新华;;禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定[J];生物工程学报;2008年07期
17 黄兵;李玉峰;王莉莉;马秀丽;田夫林;;禽腺病毒QU分离株的致病性及细胞适应性研究[J];家禽科学;2011年04期
18 朱广柱;姜永良;杨国荣;王大庸;林钧安;高佩民;张国兴;崔淑玉;;鸡包涵体肝炎禽腺病毒 分离与鉴定研究报告[J];现代畜牧兽医;1986年05期
19 朱国强,王永坤,王东华,张彪,郭进荣,金建;H_(91-1)和Y_(81)G_4两株禽腺病毒人工感染鸡血清和卵黄抗体变化的[J];中国兽医杂志;1994年05期
20 丛全滋,喻冬利,程莫生,徐占臣;一起禽腺病毒病的控制[J];中国兽医杂志;1994年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 谢芝勋;文艳玲;唐熠;谢丽基;刘加波;庞耀姗;邓显文;谢志勤;;利用Hexon主要抗原性基因重组蛋白检测禽Ⅰ群腺病毒抗体ELISA方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
2 李海英;尹燕博;郭妍妍;王建琳;王晓红;王守春;张毅;李吉达;许江涛;刘兴彩;;鸡包涵体肝炎的PCR诊断和临床病理学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
3 王纯洁;郝美艳;孙国庆;赵怀平;敖日格乐;云彦军;李表表;;鸡包涵体肝炎过程中肝脏分子免疫机理的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
4 王纯洁;贾德刚;赵怀平;敖日格乐;云彦军;李表表;;鸡包含体肝炎中B淋巴细胞、IgM及IgG变化规律的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
5 刘宇卓;李银;魏雪涛;张敬峰;;雏鹅新型病毒性肠炎的初步分离和鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
6 孙锦;黄兵;李云龙;刘玉山;刘魏;;鸭腺病毒1型病毒QU株感染性全基因组克隆的构建[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
7 陈舜;程安春;汪铭书;陈孝跃;;雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒株适应鸭胚成纤维细胞及其增殖特性研究[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集(下册)[C];2008年
8 刘岳龙;秦爱建;金文杰;崔治中;叶建强;王彬;何秀苗;;鹅源腺病毒基因组E3区的鉴定和分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
9 张春杰;李银聚;程相朝;吴庭才;郑祥海;;降落PCR法检测减蛋综合征病毒核酸的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
10 王纯洁;敖日格乐;斯日古楞;贾德刚;赵怀平;;鸡包涵体肝炎过程中血液免疫细胞变化规律的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 何秀苗;禽腺病毒载体的构建及其生物学特性的研究[D];扬州大学;2004年
2 张明明;Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建[D];扬州大学;2008年
3 黄兵;表达禽流感病毒H5血凝素禽腺病毒重组体的构建及其特性研究[D];南京农业大学;2005年
4 王建业;禽腺联病毒YZ-1株的分离、基因组克隆、基因表达及感染性病毒拯救[D];扬州大学;2008年
5 陈舜;雏鹅新型病毒性肠炎病毒强毒生物学特性研究[D];四川农业大学;2009年
6 王凤龙;鸡包涵体肝炎病原特性及肿瘤坏死因子α在其发病机理中作用的研究[D];内蒙古农业大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 虞德屏;雏鹅新型病毒性肠炎病原的研究及其PCR检测技术的建立与应用[D];广西大学;2004年
2 郝东敏;山东地区Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及多价油乳剂灭活疫苗的研制[D];山东农业大学;2014年
3 王小辉;Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[D];扬州大学;2008年
4 朱后顺;鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及其斑点杂交方法的建立[D];扬州大学;2010年
5 武敏;Ⅰ群禽腺病毒JS株Ⅲa蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制[D];扬州大学;2009年
6 张科;重组禽腺病毒JS-eGFP的生物学特性与致病性研究[D];扬州大学;2005年
7 文艳玲;禽腺病毒hexon基因克隆表达及间接ELISA和荧光PCR检测方法的建立[D];广西大学;2008年
8 崔杨;鸡包涵体肝炎病毒部分血清型DNA探针的制备及其流行病学调查[D];扬州大学;2012年
9 董婷婷;鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及其流行病学调查[D];扬州大学;2011年
10 肖妙;减蛋综合征病毒五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达及抗原性分析[D];东北农业大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 本报记者 黄妙英 翟陆;报效祖国[N];广西日报;2005年
2 徐桓;SPF鸡群与疫苗生产[N];农民日报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978