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《扬州大学》 2004年
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H9N2亚型AIV基因组序列分析及用反向遗传技术产生多个H9N2和H5重组流感病毒

卢建红  
【摘要】:目前,H5N1和H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在包括我国在内的东南亚及世界许多国家分布广泛,是流行主型,它们引起的禽流感对养禽业的严重危害性和公共卫生意义都受到关注。由于AIV亚型众多,宿主广泛,抗原易变,尤其是有野生水禽作为病毒的大储存库,禽流感是难以消灭的,只有依靠严格的生物安全措施及疫苗预防和控制。对华南(主要是香港)活禽市场的监测表明这两个亚型的病毒共存,内部基因进化活跃,这警示我们对人类流感大流行应有所准备。中国大陆有必要加强对AIV的分布、进化、致病性及新型疫苗等方面的研究。1999年以后Neumann等、Hoffmann等建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传操作系统,显示了对相关研究的良好应用前景。本研究选择1个中国大陆分离株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2),对其进行全基因组序列测定和遗传进化分析,然后将其8个基因cDNA克隆入Hoffmann等构建的双向转录/表达载体pHW2000,与A/WSN/33(H1N1)的内部基因组合,用8质粒病毒拯救系统产生了多个H9N2亚型基因重排病毒,从而建立了流感病毒的反向遗传操作技术。应用此技术,通过修饰HA基因,产生了致弱表型的H5N1和H5N2亚型基因重排病毒。 1 H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析 选择H9N2亚型分离株A/Chicken/Shanghai/F/98(C/SH/F/98),用鸡胚增殖、以蔗糖垫底高速离心纯化病毒。根据已发表的序列设计扩增8个基因的引物对,提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8个片段并测序。为获得准确的5′和3′端序列,在片段中设计特异引物、用改进的cDNA末端快速扩增法(5′/3′RACE)扩增各个基因的两端并测序。将RT-PCR和5′/3′RACE的序列比较、拼接出含5′和3′端非编码区的8个基因的全长序列。基因组全长为13597nt,片段1(PB2基因)234Int,编码759 aa的RNA聚合酶2(PB2);片段2(PB1基因)2341nt,编码757aa的RNA聚合酶1(PB1);片段3(PA基因)2233nt,编码716aa 扬州大学博士学位论文 的RNA聚合酶A(PA):片段4(HA基因)1742nt,编码560aa的血凝素(HA);片 段5(NP基因)1565nt,编码498 aa的核蛋白(NP);片段6(NA基因)1458nt, 编码466aa的神经氨酸酶(NA);片段7(M基因)1027nt,编码252aa的基质蛋 白(Ml)和97aa的离子通道(MZ):片段8(NS基因)890nt,编码Z17aa的非结 构蛋白(NSI)和12laa的出核转运蛋白(NEP/NSZ)。 8个基因的序列已发表在GenBallk,登录号为AY250750一AY250756, AF46 1 532。C/SH/F/98成为在GenBank中第一个登录序列完整的HgNZ亚型流感病 毒株,也是中国大陆第一个自主登录基因组全长序列的HgNZ亚型毒株。 从GenBank中获取1 174个发表序列长短不一的HgNZ亚型毒株的基因序列, 与C/S H/F/98的8个相应基因进行核昔酸和氨基酸序列比较,基因组序列及遗传进 化分析结果如下: C/SH邝/98完全不同于Q泪F口Gl/97,与香港流感事件没有直接关系,HA、Nsl、 pBI等蛋白保持普通}19N2亚型毒株的特性。C/SH/F/98与Q沮K/Gz/97比较,除 M基因外的7个基因同源率均低,为85.5%~93.3%,具有型特异性的M基因同源 率为96.0%。C/sH/F/98的8个基因均不在Gl一1派进化分支上。HA裂解位点序列 为队RSSR工G,是低致病性HgNZ流感病毒的模式,HA的226位受体结合位点 (对应H3亚型位置)的氨基酸为Gln,倾向于与动物细胞结合:NSI长度为217 个氨基酸:PBI基因编码区757位为赖氨酸(Lys)。而Gl一l水e毒株HA为Leu一226, 倾向于与人类细胞结合;Nsl长度为230个氨基酸;PBI多一个残基(758个), 且C端倒数第二位为Gly一757。 C/SH/F/98的HA、NA、M、NS基因是BJ94一1 ike成员,与C/Bei/l/94(BJ94) 同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%、98.0%,其中,NA基因与D/HK/Y280/97的 同源率为97.4%,而且它们的NA基因(c DNA)在205位后都缺失大多数毒株(包 括BJ94)均具有的9个核昔酸。C/SH/F/98的RNP(PBZ、PBI、PA和NP)基因不 属于1999年以前建立的已知三个稳定亚系,分别在相应的进化树上另成分支,推 测中国大陆存在这4个基因的分支。因此,C/SH/F/98是两个或两个以上基因亚系 间发生自然重排的产物。 引人注意的是,广东汕头活禽市场分离株Duc招Shimto川1 605/01与C/SH/F/98 之间除NS基因以外的7个基因同源,虽然D/STll605/01的HA和NA基因己发生 变异,但HA仍保持鸡源病毒的特点,而区别于早期的鸭源病毒株。因此,C/SH/F/98 是D/S T/1605/01的前体,C/S曰F/98的基因一直在循环并已回传给鸭,这支持“双 卢建红:HgNZ亚型AIV基因组序列分析及HgNZ和HS重组流感病毒的拯救m 向传播”的新观点.双向传播提高了整个生态系统中病毒基因型的多样性,并进 一步增加基因重排与种间传播的机会,我们应该重视H9’N2 AIV的自然进化和演 变,加强对其基因组的分子流行病学监测。 2通过产生多个HgNZ亚型的基因重排流感病毒,建立了反向遗传操作技术平台 设计带有凡脚BI、凡。1或Aarl酶切位点的引物扩增C/SH压了98的8个基因全 长片段,并在PBZ、PBI和NA基因中共引入了3个沉默突变标记。测定了双向转 剥表达载体pHWZ000的全长序列。将Cls曰F/98的8个片段克隆入pHWZ
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