地衣芽孢杆菌对灰葡萄孢的抑制机理及其抗菌蛋白研究
【摘要】：地衣芽孢杆菌W10菌株是对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等多种重要植物病原菌有拮抗作用的生防细菌。培养24h的细菌液和培养滤液有明显的抑菌作用。因此,培养滤液中存在具有抑菌活性的细菌胞外代谢产物。
培养滤液对病菌菌丝形态和生长有明显的破坏与抑制作用。滤液对菌丝形态的破坏作用主要表现为菌丝原生质收缩、菌丝细胞膨大成泡囊状、细胞壁破裂和原生质外渗等,菌丝不能继续生长,甚至完全崩解。滤液处理3h,病菌菌丝细胞开始出现异常;处理7h细胞壁即可破损,甚至细胞死亡。菌丝细胞崩解的时间随培养滤液浓度的增高而缩短。滤液稀释10倍,对菌落直径和菌丝生长量的抑制率为98.59%和68.90%;稀释2倍,对病菌产孢、孢子萌发和芽管生长的抑制率分别为83.64%、33.71%和57.69%。培养滤液随稀释倍数的增加,其抑制作用逐渐下降甚至消失。培养滤液对病菌菌核的产生和萌发同样也有一定影响。滤液稀释2倍时,对菌核形成抑制率为51.06%;滤液处理菌核后25h时,萌发率明显低于对照,但45h时所有处理的菌核萌发率均达100%,这表明培养滤液只能推迟而不能抑制菌核萌发。
培养滤液以30%硫酸铵沉淀,上清没有抑菌活性。沉淀物经透析后得粗蛋白。粗蛋白分别进行SDS-PAGE和IEF-PAGE,均出现两条蛋白带;经Sephadex G-75凝胶柱层析在280nm处有两个吸收峰。峰Ⅰ含量高,对灰葡萄孢有抑菌活性;峰Ⅱ含量低,无抑菌活性。收集峰Ⅰ即为精提蛋白。对精提蛋白进行IEF-PAGE,仅出现一条蛋白带,且与过柱前的主带相似。这表明精提蛋白中只有一种抗菌蛋白组分。以紫外吸收法测得培养滤液中抗菌蛋白浓度为621μg/ml。
经理化测定,地衣芽孢杆菌分泌的胞外抗菌蛋白分子量为46,672Da,等电点为6.71;组分中含糖6.83%,不含脂,存在无α-氨基的脯氨酸或羟脯氨酸;对热(100℃)较稳定,对胰蛋白酶、蛋白酶K、紫外线和氯仿不敏感,pH 6～12间均有抑菌活性作用,但pH6时活性最强。
【关键词】：地衣芽孢杆菌 抑制机理 抗菌蛋白 分离纯化 理化特性 灰葡萄孢 【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S476.1
【目录】：
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-10
- 前言10-23
- 一、植物病害生物防治意义10
- 二、植物病害生物防治现状10-17
- (一) 生防机理11
- (二) 生防因子种类11-16
- (三) 生防微生物的应用16-17
- 三、灰霉病及其防治17-21
- (一) 病害发生概况17-18
- (二) 化学防治及其存在的问题18
- (三) 生物防治灰霉病18-21
- 四、本研究目的和意义21-23
- 材料与方法23-34
- 一、供试菌株23
- (一) 拮抗细菌23
- (二) 植物病原真菌23
- 二、培养基23
- 三、主要试剂及仪器23-24
- (一) 主要试剂23-24
- (二) 主要仪器24
- 四、地衣芽孢杆菌培养滤液对灰葡萄孢的拮抗作用测定24-26
- (一) 培养滤液的制备24-25
- (二) 培养滤液对菌丝形态破坏作用的观察25
- (三) 培养滤液对菌丝生长的抑制作用测定25
- (四) 培养滤液对分生孢子产生、萌发和芽管生长的抑制作用测定25-26
- (五) 培养滤液对菌核产生和萌发的抑制作用测定26
- 五、抗菌蛋白的分离与纯化26-28
- (一) 硫酸铵盐析26
- (二) 样品的浓缩及脱盐26-27
- (三) Sephadex G-75凝胶柱层析27-28
- (四) 蛋白质纯度鉴定28
- (五) 蛋白质浓度的测定28
- 六、抗菌蛋白理化性质研究28-34
- (一) 抗菌蛋白显色反应28-29
- 1、茚三酮反应28
- 2、油红-0染色液的显色反应28-29
- 3、蒽酮反应29
- (二) 抗菌蛋白中含糖量的测定29
- (三) 抗菌蛋白分子量测定29-31
- (四) 抗菌蛋白等电点测定31-32
- (五) 热稳定性测定32-33
- (六) 对蛋白酶的稳定性测定33
- (七) 对酸碱的稳定性测定33
- (八) 对紫外线的稳定性33
- (九) 对氯仿的稳定性33-34
- 结果与分析34-50
- 一、地衣芽孢杆菌培养滤液的抑菌活性34
- 二、培养滤液对灰葡萄孢的作用机理34-40
- (一) 培养滤液对菌丝形态的破坏作用34-37
- (二) 培养滤液对菌丝生长的抑制作用37-38
- (三) 培养滤液对分生孢子产生、萌发和芽管生长的抑制作用38-39
- (四) 培养滤液对菌核产生和萌发的抑制作用39-40
- 三、抗菌蛋白的分离与纯化40-44
- (一) 粗蛋白的抑菌活性40-41
- (二) 精提蛋白的抑菌活性41-43
- (三) 蛋白质浓度及纯度43-44
- 四、抗菌蛋白理化性质44-50
- (一) 显色反应44-45
- 1、茚三酮反应44
- 2、油红-0染色液的显色反应44-45
- 3、蒽酮反应45
- (二) 抗菌蛋白含糖量45-46
- (三) 抗菌蛋白分子量46-47
- (四) 抗菌蛋白等电点47
- (五) 热稳定性47-48
- (六) 对蛋白酶的稳定性48
- (七) 对酸碱的稳定性48-49
- (八) 对紫外线的稳定性49
- (九) 对氯仿的稳定性49-50
- 小结与讨论50-54
- 一、小结50-51
- (一) 地衣芽孢杆菌培养滤液对灰葡萄孢的作用机理50
- (二) 抗菌蛋白的分离与纯化50-51
- (三) 抗菌蛋白性质51
- 二、讨论51-54
- (一) 地衣芽孢杆菌的应用现状及其潜力51
- (二) 地衣芽孢杆菌代谢产物51-52
- (三) 以地衣芽孢杆菌及其抗菌蛋白研制生物农药尚需研究的问题52-53
- (四) 地衣芽孢杆菌及其抗菌蛋白的应用前景53-54
- 参考文献54-64
- 致谢64
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