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《扬州大学》 2005年
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表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究

高波  
【摘要】:为了构建鸡输卵管特异表达载体,根据已经发表的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区序列设计两对引物,用高保真PCR法从中国狼山鸡基因组DNA中分别扩增出长度各为3.0kb的卵清蛋白基因5′-和3′-调控区,将扩增产物克隆入pGEM-T载体,部分序列测定结果证明与国外发表的鸡卵清蛋白基因相应区域同源性为100%。将鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区插入粘粒载体pHC20,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV1。为了证明构建的载体能有效驱动目的基因在鸡输卵管上皮细胞中表达,将绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因通过Xho Ⅰ位点克隆入pOV1载体,将获得的重组载体pOV1EGFP与脂质体或多聚阳离子(PEI)包裹后,分别转染产蛋鸡输卵管上皮细胞和成纤维细胞,转染后48 h在荧光显微镜下观察报告基因的表达,结果证明pOV1载体能有效驱动EGFP报告基因在输卵管上皮细胞中表达,而在鸡成纤维细胞中不表达。为了进一步优化pOV1载体的结构,用限制性内切酶将鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区从pOV1载体中切出,然后克隆入切除CMV启动子和SV40序列的pcDNA3.0载体,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV2;将鸡卵清蛋白基因5′-调控区单独克隆入改造后的pcDNA3.0载体,获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV3。将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3的5′-端调控区下游,获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经基因转染剂PEI包裹后,分别经翅静脉注射产蛋鸡,然后将载体注射鸡扑杀,取其输卵管和内脏组织,分别用RT-PCR和酶活性检测法测定报告基因的表达,结果显示LacZ基因在注射鸡的肝、脾、肾、心等组织不表达,在输卵管膨大部表达,而且表达的重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中。载体注射前注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用,在相同的注射剂量下,pOV3LacZ的表
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q789

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