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新城疫病毒F_(48)E_8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒

吴艳涛  
【摘要】:新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一,而新城疫病毒(NDV)F_(48)E_8株则是中国的标准嗜内脏速发型强毒。为了明确NDV F_(48)E_8株的致病机理,同时也为了研制免疫保护率高、保护期长的ND基因工程疫苗,本研究对与F_(48)E_8株致病性和免疫原性密切相关的融合蛋白(F)基因进行了克隆、序列分析,构建了表达该基因的重组鸡痘病毒(rFPV),并测定了rFPV的免疫效力。现从四个方面概述如下: 一、以酚—SDS法提纯的NDV F_(48)E_8株基因组RNA为模板,采用反转录聚合酶链反应(RT—PCR),分别扩增到长为926bp的糖蛋白基因片段和长为1710bp的F基因。以Digoxigenin标记的糖蛋白基因核酸探针能特异性地检测NDV基因组RNA,而与其它病毒RNA不发生反应。F基因RT—PCR产物则被插入到质粒载体的多克隆位点,经酶切分析和Southern分子杂交筛选到阳性重组质粒克隆pF37。 二、对NDV F_(48)E_8株F基因的序列进行全面分析。该基因编码由553个氨基酸组成的F_0前体。在第116—117位氨基酸处,F_0被切割成F1和F2多肽;切割位点的序列为RRQRR↓F,含两对碱性氨基酸,具有强毒株的特征。F_0中有3个主要由疏水性氨基酸组成的区域,其中F_2多肽N端起信号肽作用,介导蛋白质跨膜转位;F1多肽的N端是起融合作用的主要部位,亦称融合多肽;F1亚单位的C端为跨膜区。F蛋白中有两个七肽重复序列(HR1和HR2),HR1紧邻融合多肽的C端,HR2则靠近跨膜区的N端,它们能形成α螺旋结构和相互作用的疏水性界面。在F_0氨基酸序列中,发现6个可糖基化位点和12个半胱氨酸残基。F_(48)E_8株和Miyadera株、Texas GB株F_0的氨基酸同源性分别为93.64%和92.41%。根据F蛋白的酶切位点分布,F_(48)E_8株被归于基因Ⅲ型;在遗传发生上和AUS Victoria株、Miyadera株距离较近,是第一次ND世界范围内大流行的代表毒株。F_(48)E_8株和近年来国内流行的野外分离株之间,F蛋白表现出较高的同源性,主要功能区保守,因此F基因可以作为基因工程疫苗的目的基因。 三、经一系列步骤将NDV F_(48)E_8株F基因定向导入鸡痘病毒FPV插入载体pFG1175—1中痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到转移载体pFGF1175—1。以转移载体和脂质体共转染FPV中国疫苗株282E4感染的鸡胚成纤维细胞,经多次蓝斑筛选和克隆纯化,得到稳定生长的重组鸡痘病毒rFPV—NDF。间接免疫荧光试验证实,rFPV—NDF感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因。


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