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pBC-rtTA转基因小鼠模型的建立和应用

郑逸梅  
【摘要】: 四环素调控系统是对外源基因的表达水平进行严格控制的一种转基因技术系统,它能在转录水平上调控转入基因的组织特异或发育阶段的特异表达,同时还能控制其表达时间和表达量,就如在目的基因上加了个有效的“基因开关”。Tet-on系统中rtTA是反式四环素调控激活因子,它的作用跟tTA作用相反,Tet-on系统能有效的调控基因的转录表达。猿猴病毒40 T抗原基因(simianvirus 40 large T antigen,SV40T)具有转化动物细胞和诱发肿瘤的特性。SV40Tag基因已被确认为癌基因,SV40是基本的病毒致癌物质。 本研究利用分子生物学的基因克隆手段从tet-on载体上获得片段rtTA,基因克隆进乳腺特异性表达载体pBC中,成功构建了重组基因pBC-rtTA,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠,先后共注射477枚FVB小鼠受精卵,出生小鼠为117只,其中5只为pBC-rtTA转基因阳性小鼠,显微注射阳性率较高约为5%(5/117)为了避免PCR技术造成的假阳性存在,实验还进行了Southern blotting,结果显示5只小鼠的基因pBC-rtTA都整合于DNA中,将5只转基因首建鼠与正常FVB小鼠交配后,F1代外源基因pBC-rtTA的阳性率为50%,符合孟德尔遗传定律,说明pBC-rtTA基因稳定遗传。将该小鼠与本实验室已有的转基因小鼠TRE-SV40Tag进行交配即四环素调控中反应元件转基因小鼠,共出生34只小鼠,PCR检测:4只为双阳性转基因小鼠。其中31~#pBC-rtTA转基因小鼠首建鼠其后代双阳性小鼠经强力霉素饮水的诱导35d后提取心、脑、脾、肾、肺、肝、胰腺的RNA进行检测。RT-PCR结果表明:双阳性小鼠SV40Tag在心、脑上表达。 试验结果证明本实验成功建立转基因小鼠pBC-rtTA,该小鼠可作为实验室的转基因工具小鼠,是四环素调控系统中的调控元件。同时本实验也成功建立了在四环素调控系统下诱导的SV40Tag转基因肿瘤小鼠,再次证明了,四环素调控系统在基因表达调控的有效性与准确性。


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