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《扬州大学》 2007年
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稻属不同染色体组着丝粒BAC克隆的筛选及其在种间杂种研究中的应用

裔传灯  
【摘要】: 水稻是最重要的粮食作物之一,养活了世界上二分之一的人口。作为世界上最大的水稻生产和消费国家,我国一直高度重视杂交水稻和基因工程等先进技术在水稻新品种选育中的应用,期望培育出高产、稳产、品质好、抗逆性强的水稻品种。由于人口数量的持续增长,生态平衡的破坏,大量使用农药和化学肥料,以及水资源不足等原因,使我国的水稻生产面临着巨大的压力。为了更好地解决上述问题,在现代的水稻育种工作中,越来越多的水稻科学家把目光投向了野生稻,因为野生稻是一个重要的基因库,蕴藏着许多有利基因。 目前稻属约有24个种,其中亚洲栽培稻(Oryza sativa)和非洲栽培稻(Oryza glaberrima)为2个栽培种,其余为野生种,广泛分布于亚洲、非洲、澳洲、中美洲和南美洲的热带和亚热带地区。根据细胞学研究及基因组分析,稻属染色体组可分为10种,即A、B、C、D、E、F、G、H、J和K组;从不同种的染色体组构成来分,稻属有6个二倍体组型(AA、BB、CC、EE、FF和GG)和4个四倍体组型(BBCC、CCDD、HHJJ和HHKK)。稻属丰富的遗传资源,是一个的天然的基因库,利用野生稻并将其有利基因转移到栽培稻中,是当前水稻育种计划付诸实施的最重要的途径之一。为了在水稻育种实践中充分利用野生稻的有利基因,必须对野生稻种质开展系统研究。在本研究中,我们分别构建了非洲栽培稻(Oryza glaberrima,染色体组为AA)、斑点野生稻(O.punctata,染色体组为BB)、药用野生稻(O.officinalis,染色体组为CC)、澳洲野生稻(O.australiensis,染色体组为EE)、短药野生稻(O.brachyantha,染色体组为FF)和颗粒野生稻(O.granulata,染色体组为GG)的核基因组BAC(Bacterial Artificial Chromosome)文库,通过基因组文库的菌落杂交和BAC克隆的荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization,FISH)技术,分别筛选和鉴定了这6个稻种染色体着丝粒的BAC克隆,为系统研究稻属不同染色体组着丝粒的序列结构、功能及其进化关系提供了基础,也为稻属不同染色体组的识别和鉴定提供了依据。 目前野生稻有利基因在栽培稻中的应用还是相当有限的,主要原因是栽培稻与野生稻间亲缘关系较远,DNA序列间的差异大,尤其是着丝粒DNA序列的差异,造成它们种间杂种的染色体无法进行正常的配对和联会,这是导致杂种不育的重要原因。本研究利用胚拯救技术,获得了亚洲栽培稻和野生稻之间的种间杂交种,利用基因组原位杂交(Genomic in situ Hybridization,GISH)和野生稻着丝粒BAC克隆的荧光原位杂交技术(BAC-FISH)对杂种进行了鉴定,为利用野生稻的有利基因构建了研究平台。 本研究的主要研究结果如下: 构建了6个二倍体野生稻种的BAC文库,其染色体组型分别为AA、BB、CC、EE、FF和GG,覆盖了稻属的绝大部分染色体组。通过BAC克隆的脉冲电泳分析,发现这6个BAC文库的平均插入片段为60.5-92Kb。结合各BAC文库的克隆数和单倍体基因组的大小,这6个BAC文库克隆的覆盖率分别为3.7X (Oryza glaberrima), 1.2 X (O.punctata), 2.5 X (O.officinalis), 1.5 X (O.australiensis), 7.5 X (O.brachyantha)和2.6 X (O.granulata)。 将这6个野生稻的各基因组总DNA分别标记为探针,筛选相应的BAC文库,获得了一些富含重复序列的克隆。随后通过BAC克隆的FISH分析,鉴定了各染色体组的着丝粒克隆。将每一染色体组的着丝粒BAC克隆与其它5个染色体组分别进行杂交,通过共杂交分析发现(1)药用野生稻、短药野生稻和颗粒野生稻有各自着丝粒特异的卫星重复序列,短药野生稻和颗粒野生稻还有着丝粒特异的逆转座子重复序列;(2)非洲栽培稻、斑点野生稻和澳洲野生稻的着丝粒区域都包含亚洲栽培稻卫星重复序列(CentO)和逆转子重复序列(CRR)的同源序列。(3)在药用野生稻中,1条染色体着丝粒具有CentO的同源序列,所有着丝粒区域都包含栽培稻CRR的同源序列。 结合亚克隆和FISH技术,分离和鉴定了斑点野生稻和短药野生稻着丝粒特异的卫星DNA序列。对其分析表明(1)斑点野生稻的165 bp卫星重复序列(CentO)是着丝粒主要的卫星DNA序列,与亚洲栽培稻CentO的同源性很高;(2)根据序列的长度和结构,斑点野生稻CentO主要有155 bp, 165 bp和不完整的CentO三种类型,它们之间有较高的序列同源性;(3)短药野生稻154 bp的CentO-F卫星序列根据序列的同源性也可分为三种类型,即CentO-Fa, CentO-Fb and CentO-Fc,这三者间的序列同源性较低;(4)CentO-F三种类型卫星DNA在不同染色体着丝粒的分布和含量存在显著的差异,这暗示了短药野生稻着丝粒卫星DNA存在明显的分化。 以栽培稻品种与5份野生稻种杂交,借助胚拯救技术,获得了相应组合的种间杂交种。利用GISH和BAC-FISH技术,识别了这些杂种中的栽培稻和野生稻亲本的染色体,分析了杂种减数分裂的染色体配对情况。结果表明(1)种间杂交种的获得率因杂交组合而异,与野生稻和栽培稻的基因型都有关;(2)在杂种的减数分裂中,很少有染色体发生配对,绝大部分染色体以单价体形式存在;(3)在这些种间杂种的GISH鉴定过程中,通过添加封阻DNA可以消除稻属不同染色体组间同源序列共杂交的影响,从而有效地区分构成杂种的不同染色体组。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S511

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【参考文献】
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