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《扬州大学》 2007年
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人参皂苷对MPP~+诱导PC12细胞损伤的保护作用筛选研究

晋亮  
【摘要】: 帕金森病(Parkinson,s disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,目前尚无有效的根治该病的药物。本文以神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导PC12细胞损伤建立PD体外细胞模型,从9种人参皂苷中筛选出对多巴胺神经元损伤有良好保护作用的人参皂苷单体,为进一步整体动物研究提供体外实验依据,从而为开发预防和治疗PD新药提供可能的药物候选物。 1、MPP+抑制PC12细胞存活率的量效和时效关系:用MTT法测定细胞存活率。MPP+作用于PC12细胞12h、24h、48h后,细胞的光吸收值逐渐下降,12h仅在最大剂量组下降有显著性(P0.05),而24h和48h下降有极显著性意义(P0.001)。48h时存活率最低。不同浓度MPP+ 100, 200,300,400,500μmol/L作用于PC12细胞,细胞存活率随浓度增加而下降。12h时,细胞存活率分别为98.8%、93.4%、91.7%、90.7%、86.6%;24h时为91.6%、87.4%、84.8%、78.2%、73.7%;48h时为91.9%、84.4%、70.9%、56.4%、50.2%。表明MPP+能抑制细胞存活率,造成对细胞的损伤,这一作用有剂量依赖性和时间依赖性。 2、9种人参皂苷对MPP+诱导PC12细胞损伤的影响:选择9种人参皂苷单体Rg3、Rg2、Rb3、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rh2,分别给予7个浓度:0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μmol/L,然后再给与400μmol/L MPP+,培养48h后测定细胞光吸收值。模型组400μmol/L MPP+使正常细胞存活率下降到62.0%±1.9%(P0.001)。与模型组相比,人参皂苷Rg3、Rb3、Rg2和Re能显著提高细胞存活率,最高存活率Emax分别为95.9%、92.0%、76.5%、76.1%,半效浓度EC50分别为0.806、0.309、0.827、1.701μmol/L。其余5种人参皂苷Rb2、Rc、Rd、Rh1和Rh2结果为:Rb2仅低浓度(0.3125,0.625umol/L)有轻度提高存活率的作用;Rd、Rh1、Rh2在0.3125~2.5μmol/L剂量时却使存活率显著下降。Rc在低浓度(0.3125,0.625μmol/L)也有抑制作用,但20μmol/L时却使存活率轻度提高。与人参皂苷Rg3、Rb3、Rg2和Re比较,上述5种人参皂苷对细胞存活率的影响程度较小。结果表明人参皂苷Rg3、Rb3、Rg2和Re能减轻MPP+对PC12细胞的损伤。 3.人参皂苷Rg3和Rb3对MPP+诱导PC12细胞凋亡的影响:Annexin V-FITC/PI双染测定细胞凋亡率,吖啶橙/溴化乙锭染色观察细胞凋亡形态。MPP+300和400μmol/L作用48h后凋亡率从对照组39.0%±4.5%分别增加到51.2%±2.1%和64.9%±2.7%(P0.05)。MPP+虽然未使PC12细胞早期凋亡率明显增加,但却使晚期凋亡/坏死细胞显著增多。24h时400μmol/L MPP+使凋亡率由对照组的3.7%±1.2%增加到13.1%±1.7%(P0.05)。提示MPP+在本实验条件下能够诱导PC12细胞凋亡,这一作用具有剂量依赖性和时间依赖性。 先给人参皂苷Rb3或Rg3然后再给与MPP+400μmol/L,共同作用24h和48h后测定凋亡率,观察细胞形态。Rb3 2.5和5.0μmol/L 24h时凋亡率有下降趋势,但无显著意义。48h时凋亡率从模型组的64.9%±2.7%分别下降到59.8%±2.9%(P0.05)和37.3%±1.1%(P0.01)。人参皂苷Rg3 2.5,5.0μmol/L作用24h后凋亡率由13.1%±1.7%分别下降到7.3%±2.0%(P0.05)和5.6%±1.7%(P0.05) ,48h时由64.9%±2.7%分别下降到58.2%±1.6%(P0.05)和31.6%±3.2%(P0.01)。结果表明人参皂苷Rb3和Rg3能够抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡,表现出一定剂量依赖关系。 4.人参皂苷Rg3和Rb3抑制PC12细胞凋亡与ROS的关系:用流式细胞仪测定细胞内ROS。MPP+200和400μmol/L作用于PC12细胞24h和48h后,细胞内ROS显著升高,ROS比值呈剂量依赖性和时间依赖性增加。人参皂苷Rb3 2.5、5.0μmol/L作用48h后使ROS比值由模型组的1.742±0.07分别下降到1.156±0.03(P0.05)和1.182±0.08(P0.05);Rg3 2.5、5.0μmol/L也减少ROS比值,但与模型组比较无显著性差异。结果表明人参皂苷Rb3能抑制MPP+升高ROS的作用,但无剂量依赖关系,Rg3不能有效对抗MPP+对ROS的影响。提示人参皂苷Rg3和Rb3抑制PC12细胞凋亡似与ROS无关。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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