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《扬州大学》 2008年
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共表达AIV HA(H5)和NDV HN或NDV F和HN的两种重组鸡痘病毒的构建与免疫效力

徐利军  
【摘要】: 新城疫、高致病性禽流感是严重威胁我国养禽业发展及公共安全的的二种重要传染病,免疫接种是预防这两种传染病的主要措施。为克服常规疫苗的不足,研制新一代安全高效、使用方便的基因工程疫苗,我们利用新型转移载体pP12LS,分别构建了共表达AIV H5A和NDV HN基因及共表达NDV F和HN基因的两种重组鸡痘病毒,并对其免疫效力进行评估,主要内容如下: 1.表达NDV F基因和H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的构建 首先将转移载体pPE/LNA用SmaⅠ+NotⅠ进行双酶切,回收包含启动子PE/L的载体片段pPE/L;同时将质粒pTH5Am用SmaⅠ+NotⅠ进行双酶切,回收HAm基因片段,将HAm片段和载体片段pPE/L连接,得中间转移载体pPE/LHAm。将pPE/LHAm用HindⅢ酶切,回收约1.8Kb的含有PE/L启动子的HAm片段,与经HindⅢ酶切回收的线性载体pP12LSHN进行连接,得到H5A和HN基因的启动子分别为PE/L和PS,且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体pP12LSH5AHN。将pP12LSHAHN转染至已预先感染鸡痘病毒大空斑株(LP-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,pP12LSHAHN与LP-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-12LSHAHN,通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒,间接荧光试验结果表明HA和HN在细胞中均得到很好表达。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性,与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同,生长速度也未发生显著改变。 2.表达NDV F基因和HN基因的重组鸡痘病毒的构建 将近年来鹅源新城疫流行强毒株ZJ1的F和HN基因插入新型转移载体pP12LS中。F和HN基因的启动子分别为PE/L和PS,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的转移载体pP12LSFHN,通过和亲本病毒LP-FPV基因组DNA之间的同源重组获得了重组鸡痘病毒rFPV-12LSFHN;通过蓝斑筛选获得纯化病毒,间接荧光试验结果表明F和HN在细胞中均得到很好表达。与亲本病毒相比,重组病毒的空斑形成明显的合胞体,之前未见报道。而单表达新城疫病毒F基因的重组病毒rFPV-12LSF和单表达新城疫病毒HN基因的重组病毒rFPV-12LSHN都未出现感染细胞发生融合的特征,可能是由于rFPV-12LSFHN中F和HN蛋白同时并准确表达造成的,也可能和ZJ1株新城疫病毒F蛋白的强融合能力有关。此外,重组病毒的生长速率有较显著提高,并且能够达到比亲本病毒更高的病毒滴度,可能是由于融合作用加速了对邻近细胞的感染进程,此特性为疫苗生产提供了有利条件。同时,本实验也进一步证明了F蛋白的融合作用必须有HN的协助才能完成。 3. rFPV-12LSHAHN和rFPV-12LSFHN的免疫效力检测 3.1 rFPV-12LSHAHN和rFPV-12LSFHN在SPF鸡上的免疫效力检测 3.1.1 SPF鸡免疫rFPV-12LSHAHN后抵抗SY株AIV攻击的免疫保护作用 将1日龄SPF鸡随机分为3组,8只/组,隔离饲养。于14日龄分别于颈部皮下接种重组病毒rFPV-12LSHAHN、LP-FPV ,2×104PFU/只,同时设H5 AIV油苗对照组,颈部皮下接种,0.2mL/只。免疫后21d,使用SY株H5 AIV,通过滴鼻点眼途径,以5×104 ELD50/羽的剂量对各组鸡进行攻毒。攻毒后连续观察14天,统计发病死亡情况,并于攻毒后第4天和第14天采集试验鸡的气管和泄殖腔棉拭子,接种10日龄SPF鸡胚作病毒分离试验。结果表明除LP-FPV组全部死亡外,其余各组均能完全抵抗SYH5 AIV的攻击;rFPV-12LSHAHN与H5 AIV油苗免疫组在排毒方面也无显著差别。 所有试验鸡分别在免疫后7d、14d、21d采血,分离血清,用HI试验测定血清中的抗体效价。 3.1.2 SPF鸡免疫rFPV-12LSHAHN或rFPV-12LSFHN后抵抗F48E8株NDV攻击的免疫保护作用 将1日龄SPF鸡随机分为4组,8只/组,隔离饲养。10日龄时,于颈部皮下分别接种重组病毒rFPV-12LSHAHN、rFPV-12LSFHN、LP-FPV,2×104PFU/只,同时设ZJ1株NDV油苗对照组,颈部皮下接种,0.2mL/只。免疫后21d,每只试验鸡接种5×107ELD50的F48E8株NDV,攻毒后连续观察14天,统计发病死亡情况,并于攻毒后第5天和第10天采集试验鸡的气管和泄殖腔棉拭子,接种10日龄SPF鸡胚作病毒分离试验。结果表明除LP-FPV组全部死亡外,其余均能抵抗F48E8株NDV的攻击,排毒方面也无显著差别。 所有试验鸡分别在免疫后7d、14d、21d采血,分离血清,用HI试验测定血清中的抗体效价。 3.2商品鸡免疫rFPV-12LSHAHN后抵抗SY株AIV攻击的免疫保护作用将1日龄商品鸡随机分为3组,20只/组,隔离饲养。于10日龄分别于颈部皮下接种重组病毒rFPV-12LSHAHN、LP-FPV ,2×105PFU/只,同时设H5 AIV油苗对照组,颈部皮下接种,0.2mL/只。免疫后28d,使用SY株H5 AIV,通过滴鼻点眼途径,以5×104 ELD50/羽的剂量对各组鸡进行攻毒。攻毒后连续观察14天,统计发病死亡情况,并于攻毒后第4天和第14天采集试验鸡的气管和泄殖腔棉拭子,接种10日龄SPF鸡胚作病毒分离试验。结果表明由于母源抗体的干扰,重组病毒在商品蛋鸡体内诱生的HI抗体效价远低于他们在SPF鸡体内诱生的HI效价,但仍能够提供显著水平的死亡保护,免疫鸡的排毒率与油苗免疫组亦无显著差异。 综上所述,重组鸡痘病毒rFPV-12LSH5AHN与rFPV-12LSFHN在SPF鸡上均具有理想的免疫保护作用;在有较高水平的母源抗体的商品蛋鸡上,重组病毒也具有较好的保护效力,它们与油苗的免疫效力相当,显示出一定的应用前景。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.5

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【参考文献】
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