粘帚霉GR菌株高产β-1，3-葡聚糖酶诱变、酶分离与性质研究及菌株鉴定

【摘要】： GR菌株是一株生防真菌,对多种病原菌具有抑制作用。对该菌菌落形态、分生孢子形态与产孢结构进行观察,结合ITS DNA序列分析,将GR菌株初步鉴定为粉红粘帚霉。 GR菌株能分泌β-1,3-葡聚糖酶。用粗酶液进行抑菌试验表明,其对水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌菌丝生长具有明显的抑制作用,还能导致水稻纹枯病菌菌丝颜色变浅,细胞肿胀,原生质体浓缩,严重的出现菌丝断裂；使棉花黄萎病菌菌丝顶端细胞膨大呈球形,甚至破裂,原生质体外渗。 用紫外线对GR菌株进行诱变,获得一株产β-1,3-葡聚糖酶活性增加的突变株GR-6,其酶活性是亲本菌株的2.8倍,且其产酶性状能稳定遗传。对突变株GR-6进行生物学特性检测,与亲本菌株相比,生长速度、分生孢子产生等性状基本相似,因此GR-6是较为理想的高产β-1,3-葡聚糖酶的生防菌株。 GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶能够用60%丙酮完全沉淀,悬浮于缓冲液中得粗酶液。粗酶液经过DE52离子交换层析,在280nm处有5个吸收峰,其中峰4具有β-1,3-葡聚糖酶活性,且含量最高；收集峰4蛋白将其再经Sephadex G-75凝胶柱层析,在280nm处有3个活性峰,其中峰4-1为具有酶活性的蛋白峰。对4-1蛋白进行SDS-PAGE电泳,展现一条蛋白带,分子量为41.1kDa。 GR-6产生的β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为4-5,β-1,3-葡聚糖酶活性稳定性测试结果表明,酶液在50℃以下温度处理30min,酶解性质稳定,但60℃处理30min后活性明显下降。酶液在pH5条件下处理2h,活性基本不变,但在pH4、pH6时活性明显降低。该葡聚糖酶对一些金属离子较敏感,如Ca2+、zn2+、Fe2+、Fe3+、Ba2+等使酶活性显著降低,而Mn2+和K+对酶活性没有明显的影响。 对GR-6菌株产β-1,3-葡聚糖酶的培养条件进行了优化,得出最佳碳源为2%葡聚糖,最佳氮源为0.7%硝酸铵,培养基pH值为5,培养温度为26℃,培养时间为14d。