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《扬州大学》 2010年
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2005-2008年华东地区NDV遗传进化分析和代表性毒株感染细胞的比较蛋白质组研究

吴双  
【摘要】: 新城疫(Newcastle disease, ND)为能感染多种禽类的一种急性、高度传染性疫病,给世界养禽业造成巨大的经济损失。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属于副粘病毒科,禽腮腺炎病毒属,其基因组由单股负链RNA构成,基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L),其中病毒囊膜表面的两种糖蛋白F和HN是构成NDV致病性的主要分子基础。本研究对2005-2008年间分离自华东地区的79株NDV的F基因和HN基因序列进行了测序和遗传进化分析,发现分离株在基因型和毒力上具有明显的多样性,但基因Ⅶd亚型仍然是我国流行的优势基因型;在NDV的遗传进化分析基础上,选取了三株不同遗传背景的NDV进行体内外的致病性试验,结果表明:基因Ⅶ型NDV对鸽、鸡和鹅均呈现出高致病性,鸽源Ⅵb亚型NDV具有明显宿主感染特异性;为了进一步探讨NDV在细胞分子水平上的致病机制以及三株NDV之间的致病性差异,本研究还运用比较蛋白质组方法对上述三株NDV感染细胞后的差异表达蛋白进行了初步分析。 1. 2005-2008年我国华东地区新城疫病毒分离株的遗传进化分析 对2005-2008年间从我国华东地区发病的鸡、鹅、鸽等禽类中所分离出的79株NDV进行了生物学特性和基因型鉴定。F和HN基因的遗传进化分析结果一致表明:79个分离株中,有3株弱毒为class I谱系;76株为class II谱系,其中基因Ⅰ型NDV弱毒1株,基因Ⅱ型NDV弱毒12株,基因Ⅲ型NDV强毒2株,基因Ⅵ型中等毒力NDV 4株,其它57株NDV强毒分离株均属于基因Ⅶd亚型。Ⅶd亚型毒株占到了所有分离强毒株的96%以上,表明Ⅶd亚型NDV仍然是我国当前流行的优势基因型。序列比对结果显示,基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分离株与疫苗株V4、La Sota和Mukteswar的同源性分别为99.6%、96.2~99%和99.9%,由此,这些毒株可能来源于临床上广泛使用的疫苗株;4株基因Ⅵb亚型NDV均为鸽源分离株,暗示该亚型NDV具有强的宿主感染特异性。在遗传进化树上,57个Ⅶd亚型NDV可进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个分支,近两年分离的大多数毒株属于Ⅶd2分支,与Ⅶd1分支中NDV相比,Ⅶd2中的NDV在F蛋白分别出现了4处突变:N145K、Q279H、K387R和F512I;在HN蛋白也出现3处突变,分别为:T102I、A118E和T443M。我国新城疫病毒分离株在毒力与基因型所呈现出的多样性,为研究不同遗传背景毒株之间的致病性差异提供了理想的生物材料。 2.不同遗传背景NDV体内外致病性 在NDV的遗传进化分析基础上选取鹅源毒株JS-5-05-Go(基因Ⅶd亚型)、鸽源毒株WX-10-07-Pi(基因Ⅵb亚型)和鸡源毒株JS-7-05-Ch(基因Ⅲ型)三个不同遗传背景的NDV进行体内外的致病性试验。三株不同遗传背景NDV均以0.01MOI接种量感染鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸭胚成纤维细胞(DEF)和鹅胚成纤维细胞(GEF),结果显示JS-5-05-Go感染三种细胞的上清HA峰值均比其它两株病毒高,WX-10-07-Pi感染后三种细胞上清HA峰值相同,JS-7-05-Ch感染后三种细胞上清HA峰值差异显著;三株NDV感染GEF细胞崩解过程均比DEF缓慢。动物试验中,我们以上述三株NDV和标准强毒株F48E8经自然感染途径分别感染鸽、SPF鸡和鹅三种试验动物,结果显示,仅JS-5-05-Go和F48E8引起感染鸽的死亡,且只有JS-5-05-Go和WX-10-07-Pi毒株导致鸽泄殖腔出现间歇排毒。WX-10-07-Pi攻毒组鸽泄殖腔排毒时间最长、且病毒检出率较其它组要高,因此与其它基因型NDV相比,基因Ⅵb亚型NDV更易在鸽群中感染传播。SPF鸡感染试验结果表明,JS-7-05-Ch虽为强毒株,但是对鸡的致病性较弱,但其余3株NDV对鸡的致病力与其毒力呈正相关。四株NDV对鹅的致病力差异显著,致病力从强到弱依次为F48E8、JS-5-05-Go、JS-7-05-Ch和WX-10-07-Pi,WX-10-07-Pi几乎不引发鹅的临床症状;F48E8和JS-5-05-Go试验组在9种脏器组织中病毒检测率、喉头和泄殖腔排毒差异不显著。 3.不同遗传背景新城疫病毒感染CEF的比较蛋白质组研究 为了在细胞蛋白水平研究三株不同遗传背景NDV和宿主细胞之间的相互作用关系,本研究以感染了NDV的CEF为研究对象,采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)的比较蛋白质组研究方法,分析三株NDV感染CEF后24h和48h两个时间点细胞蛋白表达动态。双向凝胶图谱的差异表达分析显示,CEF感染三株NDV后,共有43个蛋白点出现了显著的差异表达,包括持续上调、持续下调、先期上调后期下调以及先期下调后期上调四种表达方式,部分蛋白点在不同的感染组中表达水平有所差异。采用MALDI-TOF-MS质谱法对43个差异表达蛋白点进行质谱鉴定,结果成功鉴定了41个蛋白点,对应39种蛋白质。根据蛋白的功能不同,这些差异表达蛋白涉及病毒结构蛋白(2%)、细胞骨架(43%)、应激反应(10%)、蛋白质翻译和合成(7%)、RNA加工和合成(12%)、能量代谢(7%)、泛素-蛋白酶体途径(2%)、信号传导(12%)以及一些功能未知蛋白(7%)。应用Western-blot分析方法验证了β-actin和α-tubulin的蛋白表达水平,其结果与2-DE的分析数据完全相符。根据差异表达蛋白的功能,推测在新城疫病毒感染细胞时,病毒可通过热休克蛋白27(HSP27)、硫氧还蛋白域5(TXNDC5)和核磷蛋白(NPM1)等蛋白的上调表达来抑制或延缓细胞的早期凋亡;同时,翻译延长因子Tu(EF-Tu)和40S核糖体蛋白SA(PRSA)上调表达有利于病毒自身蛋白质的合成;另外,细胞对于NDV的感染也具有一定的防御机制,热休克蛋白90kDa(GRP94)上调表达导致细胞凋亡增加。 比较蛋白质给学试验结果显示,不同遗传背景NDV感染细胞中部分蛋白的表达水平存在明显差异。细胞微丝蛋白β-肌动蛋白(ACTB)和细胞质类型肌动蛋白8(ACTG8)、信号传导蛋白核仁素(C23)、含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白(SGT)和14-3-3E蛋白(14-3-3E)以及参与蛋白翻译和合成的TXNDC5等与WX-10-07-Pi本身感染特性有关;细胞骨架蛋白中α-微管蛋白(TUBA)、角蛋白19(KRT19)、网素3(PLS3)和肌动蛋白加帽蛋白(CAPZA2),RNA加工蛋白中的不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)以及功能未知的类人含46卷曲螺旋结构域(CCDC46)等与JS-7-05-Ch自身感染特性有关;而细胞骨架蛋白中波形纤维蛋白(VIM)和Β1-链微管蛋白(TUBA1C)、热应激蛋白Grp94、蛋白翻译蛋白EF-Tu以及早期内体抗原1(EEA1)等蛋白表达水平的变化与JS-5-05-Go本身感染特性有关。 全文小结: (1) 2005-2008年间共分离鉴定NDV 79株,分离株在基因型和毒力上具有明显的多样性。基因Ⅶd亚型仍然是我国流行的优势基因型,该亚型目前已出现了Ⅶd1和基因Ⅶd2两个分支。 (2)基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型NDV田间分离株与当前使用的疫苗毒株关系密切,推测这些田间分离株是疫苗株的变异株。与其它基因型毒株相比,鸽源Ⅵb亚型NDV具有明显的宿主感染特异性。 (3)本研究首次应用比较蛋白质组方法研究不同遗传背景NDV感染CEF细胞后的差异表达的蛋白,质谱鉴定41个差异表达的蛋白,对应39种差异表达蛋白。 (4) NDV感染细胞后改变了细胞骨架、影响泛素-蛋白酶体途径的稳定、破坏了宿主翻译机制、抑制细胞RNA的加工和能量代谢。 (5)不同遗传背景NDV感染细胞后均出现与其本身特性相关的蛋白质。 (6) NDV除通过膜融合进入细胞外,还可能通过胞吞途径进入细胞。与其它两株病毒相比,胞吞作用在JS-5-05-Go进入细胞的过程中,可以发挥更长时间的效应。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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7 龚伟,金宁一,薛立娟,罗琴芳,孙大辉,葛涛,李萍;NDV长春株和四平株HN/F核酸疫苗的构建及表达[J];中国兽医学报;2002年02期
8 李燕,王恩秀,陈溥言;血吸附法浓缩NDV病毒及与其他几种方法的比较[J];生物技术;2002年02期
9 罗琴芳,金宁一,钱剑;鸡新城疫病毒(NDV)HN蛋白基因核酸疫苗的构建与血凝活性测定[J];塔里木农垦大学学报;2002年02期
10 汤承;岳华;吴宣;杨泽林;傅安静;;鸡新城疫强毒分离株SC01的分子特性及与La Sota和F48E8的交叉保护[J];西南民族大学学报(自然科学版);2006年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡北侠;王艳;杨少华;徐怀英;黄艳艳;张秀美;;产蛋下降鸭群强毒NDV的分离鉴定与分子特征[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
2 孙英杰;陈鸿军;仇旭升;宋翠萍;于洋;于圣青;丁铲;;Class Ⅰ NDV强毒株主要结构蛋白特异性抗体的研制[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
3 宋卉;彭克美;谢东;刘华珍;刘敏;陈曦;;鸡源NDV人工感染雏鸵鸟对机体免疫调节的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
4 张登荣;石玉祥;王世英;任大卫;;中药口服液对NDV的体外作用及其防治效果研究[A];2010畜牧业与低碳经济科技论文集[C];2010年
5 唐丽;彭克美;;NDV对雏鸵鸟HPA轴的影响研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
6 唐思静;赵艳敏;潘洁;师小潇;刘惠莉;;大肠杆菌热敏性肠毒素对NDV疫苗免疫增强效果研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
7 宋德志;黄川;姜艳华;赖振屏;黄企光;茅乃权;杨建林;樊晓晖;;NDV对小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
8 孙静;刁有祥;刘霞;孙杰;李建侠;程彦丽;;肉鸡呼吸道病料中AIV、NDV、IBV、aMPV共感染的检测[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
9 孟春春;张向乐;孙英杰;仇旭升;陈鸿军;于圣青;丁铲;;新城疫病毒感染肿瘤细胞后能诱导自噬的发生[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
10 王开功;文明;周碧君;殷俊磊;伍祥龙;温贵兰;;贵州省新城疫分子流行病学研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 王卓铭 实习记者 李亚蝉;甲型流感毒株运抵企业 联盟、联动机制加速疫苗生产[N];21世纪经济报道;2009年
2 陈勇;美官员称必须研制针对新毒株禽流感疫苗[N];农资导报;2006年
3 扬州大学畜牧兽医学院病原微生物研究室 王永坤教授;新城疫有新动向 防制对策需跟上[N];中国畜牧报;2002年
4 陈艳阳;今冬重点防范三大流感毒株[N];大众卫生报;2007年
5 王丰丰;分离出病毒毒株,美疫苗研发获进展[N];新华每日电讯;2009年
6 王迪;FluChip速擒禽流感毒株[N];医药经济报;2006年
7 瑞普(保定)生物药业有限公司 尤永君 王延树;不同抗原含量鸡新城疫油苗对鸡体液免疫应答的影响[N];中国畜牧兽医报;2009年
8 记者 柯轩 通讯员 粤科宣;广东已成功分离首个甲流病毒株[N];广东科技报;2009年
9 记者 崔静;一企业首获甲型H1N1流感疫苗生产用毒株[N];经济参考报;2009年
10 建华;全国HIV毒株的基因变异和流行特征数据库建立[N];中国医药报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴双;2005-2008年华东地区NDV遗传进化分析和代表性毒株感染细胞的比较蛋白质组研究[D];扬州大学;2010年
2 闫振贵;不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D];山东农业大学;2011年
3 蔡丽娅;临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用[D];扬州大学;2009年
4 梁俊文;新城疫分离株P和HN基因分子进化与致病性的相关研究[D];山东师范大学;2010年
5 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
6 刘培欣;新城疫病毒单克隆抗体制备及部分NP蛋白抗原表位鉴定分析[D];东北农业大学;2011年
7 岳华;新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测及RNA干涉[D];西南大学;2006年
8 孟春春;ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染肿瘤细胞中的作用[D];中国农业科学院;2012年
9 于淼;山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D];南京农业大学;2009年
10 胡海霞;表达C亚型禽偏肺病毒糖蛋白和融合蛋白的重组新城疫病毒二价苗的构建及免疫效力评价[D];吉林大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高灵茜;NDV 7793野生株的纯化、毒力测定及全基因组序列测定[D];广西医科大学;2010年
2 宫金伶;NDV7793刺激小鼠单核—巨噬细胞对肝癌细胞的杀伤作用[D];广西医科大学;2011年
3 管峰;新城疫病毒鸭源分离株NDV08-004微型基因组与全基因组的构建[D];扬州大学;2010年
4 丁娜;鹅RIG-I在抗NDV先天性免疫中的作用[D];中国农业科学院;2012年
5 张渭东;秦岭野鸟源NDV的致病性研究及F、HN基因的遗传进化分析[D];西北农林科技大学;2012年
6 刘峰;新城疫免疫程序的优化[D];湖南农业大学;2010年
7 王静;新城疫病毒诱导人食管癌ECA109细胞凋亡及其信号转导途径的研究[D];河北北方学院;2011年
8 刘新雷;“复方金银花制剂”对NDV人工感染雏鸡病理学变化的影响[D];东北农业大学;2012年
9 豆艳丽;抗新城疫病毒中药筛选及其复方的动物试验[D];甘肃农业大学;2012年
10 鲁建刚;信阳地区鸡新城疫的流行病学调查[D];河南农业大学;2009年
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