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《扬州大学》 2010年
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禽病原性大肠杆菌E516株与尿道致病性大肠杆菌U56株毒力基因相关性与体内外表达差异的研究

高清清  
【摘要】: 尿道感染是一种严重危害人类健康的常见病,40%-50%的妇女至少经历过一次尿道感染,临床表现多样(尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎等),仅在美国,每年即有大约8百万人罹患该病,住院患者约30万。迄今,尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli, UPEC)是所有尿道感染中最常见的病原体。禽大肠杆菌病是部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病,CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。 APEC和UPEC均能引起肠道外感染,具有广泛的致病潜能。基于这种广泛的致病潜能,UPEC和APEC被归为新型致病性大肠杆菌——肠道外病原性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)。APEC和UPEC引起肠道外感染可能与它们的毒力特性有关,如黏附素、铁摄取系统、毒素、保护素和侵袭素等,这些毒力特性使它们能够在宿主环境中生存进而产生疾病。诸多研究证明,APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。 本研究选取代表性APEC、UPEC分离株,比较它们的种系发生分型及毒力基因的分布,并通过SPF鸡对它们的致病性进行鉴定,同时比较APEC和UPEC在鸡和小鼠体内外竞争性生长情况;通过感染实验小鼠和鸡,应用相对定量反转录PCR测定受试毒力基因在体内的表达水平,从而揭示APEC、UPEC毒力基因在同一宿主体内的表达规律,最终为弄清APEC与UPEC是否作为对方毒力基因贮库这一关键问题提供依据。相对定量PCR对APEC和UPEC毒力基因在体内表达水平的检测结果,结合PCR检测毒力基因的分布以及对SPF鸡致病性试验的结果,说明APEC和UPEC在毒力基因方面的相关性。 选取同属O1血清型禽致病性大肠杆菌分离株E516和人尿道致病性大肠杆菌U56株,应用单一和多重PCR技术比较它们的种系发生分型及毒力基因的分布,并通过SPF鸡对它们的致病性进行鉴定,同时以肠出血性大肠杆菌代表菌株933和非致病性大肠杆菌代表菌株K-12 MG1655作对照;并比较APEC E516株和UPEC U56株在鸡和小鼠体内外竞争性生长情况。结果显示,E516株和U56株种系发生型一致,在毒力基因相似性高;对1日龄SPF鸡致病力测定结果表明U56株能产生与E516株相似的病变,但是致病力略低于E516;鸡和小鼠体内竞争性试验结果显示U56竞争力略低于E516,这可能与两者仍存在不同的已知或未知的毒力因子有关。上述研究部分佐证了APEC可能是UPEC的来源或UPEC的毒力基因储存库的推论。 本研究用嵌合荧光(SYBR GreenⅠ)标记,以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因,建立了用于ompT和feoB基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR (real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)。运用该定量PCR分别建立了内参基因gapA和目的基因ompT与feoB的3个标准曲线,这些标准曲线的斜率和线性关系均符合要求,表明所建立的定量PCR体系的扩增效率高、定量准确。定量PCR对ompT和feoB基因在感染鸡体内及小鼠体内的表达水平的解析结果表明,相对于体外培养,APEC E516株ompT在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了3.73和1.45倍,feoB在鸡体内上调了1.30倍,在小鼠体内表现下调趋势,下调率为0.84;UPEC U56株ompT在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了1.52和2.57倍,feoB在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了2.15和1.37倍;而对照菌株EHEC 933和K-12 ompT与feoB在鸡体内和小鼠体内的表达均表现下调。上述结果提示我们,APEC、UPEC毒力基因ompT和feoB在鸡攻毒模型和小鼠尿道感染模型中的表达水平基本一致,多表现为上调,即它们可能是APEC和UPEC的致病基因。
【学位授予单位】:扬州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.61

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