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《仲恺农业工程学院》 2016年
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副猪嗜血杆菌sapA基因的鉴定与生物学特性研究

郭海祥  
【摘要】:副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS),革兰氏阴性杆菌,属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。研究表明抗菌肽敏感基因sapA在多种革兰氏阴性菌中对阻断抗菌肽有重要作用,在与HPS同科同属的流感嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌中,sapA基因已被证实是一个重要的毒力因子,而目前对于该基因在HPS的情况尚未有研究报道。本研究对从患病猪肺组织中分离到的HPS菌株H31(血清12型强毒菌株)进行了sapA基因的克隆与测序,运用生物信息学软件预测发现该菌sapA基因编码蛋白具有丰富的二级结构和良好的抗原性;鉴定并分析了sapA基因在66株HPS中的分布情况,发现仅29株存在该基因,推测该基因只存在于毒力菌株中,但由于所选用菌株数量有限,该结果需进一步确认研究;测序并分析了29个sapA基因表明该基因在不同菌株中高度同源。构建了sapA基因原核表达载体pET-32a(sapA)并摸索优化了表达条件,大量表达、纯化了一批具有生物学活性的sapA蛋白(浓度195μg/mL);制备了sapA蛋白兔抗高免血清并建立了间接ELISA检测血清sapA蛋白抗体的方法;间接ELISA、western blot检测发现sapA蛋白能够很好地识别H31血清,表明具有良好的免疫原性;间接免疫荧光法、western blot法发现提取的H31细菌胞质蛋白能够与sapA蛋白高免血清发生特异性免疫印迹反应,表明sapA蛋白存在于细菌细胞胞质中;血清杀菌试验发现sapA蛋白血清作用下细菌存活率较阴性对照有明显提高,表明sapA蛋白抗体促进细菌繁殖生长;sapA蛋白阻断试验发现sapA蛋白对抗菌肽杀菌有良好的阻断作用,且阻断后一定程度上促进了细菌的生长,推测sapA蛋白结合了抗菌肽并将其分解成氨基酸以供细菌生长利用,促进了细菌的生长繁殖。动物试验发现高水平sapA蛋白抗体加剧了豚鼠在HPS攻毒后的发病与死亡,验证了血清杀菌试验结果,证明sapA基因是一个重要的毒力因子。本文首次对HPS的sapA基因进行了鉴定和研究,分析、预测了其序列和编码蛋白特性,并成功构建了原核表达载体,高效表达、纯化得到了一批具有生物学活性的sapA融合表达蛋白。鉴定了蛋白的免疫原性,定位了蛋白的细菌亚细胞位置,体外试验验证了sapA蛋白血清的杀菌效应和sapA蛋白阻断抗菌肽杀菌效应,体内试验验证了sapA基因是HPS的一个重要的毒力因子。为以后副猪嗜血杆菌sapA基因的研究以及疫苗的开发提供参考。
【学位授予单位】:仲恺农业工程学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.61

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