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《仲恺农业工程学院》 2019年
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基于转录组学的蜂蜜接合酵母高糖耐受机制研究

毕新煜  
【摘要】:酵母菌的高糖耐受性能是其重要的抗逆性能之一。研究酵母菌的高糖耐受机制,对酒精浓醪发酵和客家黄酒酿造具有重要的参考价值。目前,对酵母菌高糖耐受机制的研究仅限于代谢水平,尚未明确控制酵母菌高糖耐受性能的基因及对应途径。本论文从已筛选的一株可耐受700 g/L高糖浓度的酵母菌出发,对其基本性能进行检测并采用核糖体18S rDNA、ITS、26S rDNA D1/D2基因区序列等分子生物学鉴定方法确认其种属信息;通过基因组学测序得到完整的酵母菌基因组信息;利用转录组学研究耐高糖酵母在不同糖浓度条件下的基因表达,从RNA水平分析高糖胁迫条件下耐高糖酵母基因表达的差异,结合不同浓度高糖胁迫下酵母生理特征和应激代谢产物的变化特性,筛选与酵母菌高糖耐受性能有关的代谢途径中的关键基因;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果的准确性并对可能与酵母菌高糖耐受性相关代谢途径中的关键基因的表达进行分析,在转录组水平阐述酵母菌耐受高糖的机制。研究结果如下:(1)通过形态学特征,分子生物学特征对筛选到的耐高糖酵母LGL-1进行全面系统的鉴定。耐高糖酵母LGL-1在700 g/L葡萄糖浓度下能够正常生长,对数生长期为20-40 h,采用rDNA-ITS、18S rDNA、26S rDNA三种测序方法进行种属鉴定,鉴定结果为蜂蜜接合酵母(Zygosaccharomyces mellis)。(2)采用第三代基因组测序技术,完成了蜂蜜接合酵母LGL-1的基因组测序、组装以及质量评估。总测序深度约为130×,基因组大小约为19.98 Mb。利用相关的生物信息学软件对蜂蜜接合酵母LGL-1基因组进行注释,共注释到9528个基因,匹配到106种KEGG通路,包括氨基酸的生物合成途径、碳水化合物代谢途径等。(3)选取300 g/L、500 g/L、700 g/L高糖浓度下培养的蜂蜜接合酵母LGL-1进行转录组学测序,将测序得到的转录本进行组装拼接后与参考基因组序列进行比对,各组的比对效率在94.26%~95.90%之间。在三个不同糖浓度的分组中,蜂蜜接合酵母LGL-1的差异表达基因数量分别为2155个、754个、3388个;分别有2000个、678个、3152个基因在GO分析中得到功能注释;分别有941、1578、361个差异表达基因得到COG数据库的分类。在三个分组中,涉及到的不同代谢通路分别有103个、108个、98个。涉及到基因占比较多的通路是,抗生素的生物合成、碳源代谢、氨基酸生物合成、酵母细胞周期、酵母MAPK信号通路和嘌呤代谢。(4)选取了与蜂蜜接合酵母LGL-1高糖耐受性相关的三个主要代谢途径(HOG-MAPK信号途径、海藻糖代谢途径和嘌呤代谢途径)中明显上调和下调的关键基因以及其他途径中的基因共25个,进行荧光定量PCR(qRT-PCR)验证实验,表达量变化倍数与转录组的测序结果基本一致。其中,sho1、sln1、ssk1、gpd1、hog1;tps、otsb;amd、rpc等关键基因可能与蜂蜜接合酵母LGL-1的高糖耐受机制有关。
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