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《仲恺农业工程学院》 2019年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

陈汉锶  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是以母猪繁殖障碍、各年龄猪的呼吸道症状及仔猪的高死亡率为特征的一种病毒性疾病。这种疾病对养殖业造成巨大的经济损失,因此及时准确掌握PRRSV的流行情况和疫苗免疫状况并提出正确的防控措施至关重要。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)变异快,具有免疫抑制、持续性感染的特性,这使其很难得以控制。现阶段PRRS的防控主要通过疫苗的接种和生物安全的严格把关。PRRSV抗体检测试剂盒可应用于检测血清中PRRSV抗体,监测PRRS的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。为研制特异性敏感性较好的PRRSV抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测及评价相关疫苗的免疫效果,本研究将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到pET-32a载体中,成功构建重组克隆载体pET-32a-N并转化于大肠杆菌BL21(DE3)。通过优化诱导表达的条件,实现了N蛋白以可溶性的表达方式高效表达;通过Western blot实验,证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性;通过优化蛋白纯化条件,最终确定含100mM咪唑的洗脱液能纯化出纯度较高的N蛋白,测定蛋白浓度为250μg/mL。以纯化的N蛋白作为PRRSV抗体间接ELISA检测方法的包被抗原,对各参数和试剂进行优化;用建立的ELISA检测方法检测52份已知PRRSV抗体阴性的猪血清;并根据阴性血清样品OD450值计算其SP值的平均值(x)和标准差(s),确定了临界值S/P值≥0.172时为阳性,S/P值0.085时为阴性,介于两者之间为可疑。接下来对方法的特异性、重复性和敏感性进行试验,试验结果表明:用所建立的PRRSV抗体检测方法检测伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪肺炎支原体(MHP)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)、副猪嗜血杆菌(HPS)等阳性血清,S/P值均小于0.085,证明建立的ELISA检测方法特异性较好;在批内重复和批间重复试验中,每个试验血清检测值之间的变异系数均小于10%,进一步表明ELISA方法有较好的重复性;敏感性试验中,强弱阳性血清80倍稀释的检测结果仍为阳性,表明建立的ELISA检测方法敏感性较好。最后,利用本试验建立的间接ELISA方法和IDEXX PRRSV ELISA抗体检测试剂盒同时检测196份临床血清样品。试验结果表明,与IDEXX公司ELISA检测试剂盒的结果相比,本试验建立的间接ELISA方法相对特异性高达96%,两者之间一致性达到91%。综上结果,表明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性敏感性良好,可应用于检测猪血清中的PRRSV抗体,监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。
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