用于微囊藻毒素检测的DNA芯片的构建

【摘要】：本文以16S rDNA、16S-23S rDNA、微囊藻毒素合成酶基因作为基因芯片检测的靶片段，针对实验室培养的13株常见微囊藻（Microcystis aeruginosa、Microcystiswesenbergii、Microcystis elabens、Microcystis viridis、Microcystis ichyoblabe、Microcystisflos-aquae）展开一系列研究，以期望获得用于快速检测水体中有毒微囊藻的特异性探针并尝试进行检测芯片的构建。 以细菌的16S rDNA通用引物1492R和27F对13株微囊藻进行了16S rDNA测序分析，结果显示，13株微囊藻中，9株藻株（MA-1、MA-2、MA-3、MF-1、MF-2、MF-3、MW-1、MW-2、MI-1）与已知的Microcystis序列具有较高的相似性，相似度从99%-100%不等，而另外4株藻株（MF-4、ME-1、MV-1、MV-2）与数据库中的已知的Microcystis序列无相似性。因此，我们对前述9株微囊藻展开比对分析。分析显示，微囊藻种间及亚种间的序列差异度极小，很难据此设计用于种及以下水平鉴别的特异性探针。 随后，对该9株淡水微囊藻的16S-23S rDNA ITS序列进行测序，并结合NCBI数据库中已有的微囊藻ITS序列进行差异性分析，最终筛选了18个用于微囊藻种间及亚种鉴定的探针。结果表明，设计的18个探针的错配率很高，不能有效区分这9株微囊藻。因此，我们根据实际应用的需要，从这9株微囊藻中选择了3株具有代表性的微囊藻藻株，并基于其ITS序列的差异性分析，重新设计了9个探针，结果显示，其中7个探针有较好的特异性，能用于未来芯片的构建。 通过微囊藻毒素合成酶基因的序列分析，我们设计了6个用于检测微囊藻毒素的特异性探针，并对每个探针进行了单独的芯片验证，结果显示，每个探针均给出了预期的检测信号。为减少芯片实际应用时的PCR预处理的次数，我们构建了一个包含6个毒素探针在内的多重PCR体系，并对该多重PCR体系进行了多因素优化，最终确定其多重PCR扩增条件为：50μl反应体系中，荧光标记引物与非荧光标记引物比例均为1﹕1。Taq酶（5U/μl）0.4μl，dNTP（2.5μM）4.5μl、Mg~(2+)（25mM）3.5μl、引物（10μM）各1.5μl。退火温度为51.0℃。 以先前设计的9个微囊藻ITS序列探针和6个微囊藻毒素探针为基础，我们设计构建了一张用于检测有毒微囊藻的DNA芯片，并选取3株具有代表性的微囊藻藻种（Microcystis aeruginosa、Microcystis wesenbergii、Microcystisviridis）对该DNA芯片的准确性进行了验证，结果显示，除毒素探针AMA未给出相应的杂交信号外，DNA芯片上的其余几个ITS探针和毒素探针均给出了预期的芯片检测信号。 综上所述，本研究建立的微囊藻毒素DNA芯片检测方法，具有快速、特异、高通量等特点。为今后自然水体中潜在微囊藻毒素的实时监测和水质安全分析提供了新的方法。同时，也为未来用于其他蓝藻毒素检测的DNA芯片的构建提供了可供参考的思路。

【关键词】：DNA芯片 微囊藻毒素合成酶基因 多重PCR
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：Q94-3
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