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《宁波大学》 2017年
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三丁基锡肝细胞毒性的转录组学研究

周密  
【摘要】:目的:三丁基锡(tributyltin,TBT)是一种广泛使用的有机锡化合物,可对海洋生物和哺乳动物造成严重的危害,主要包括生殖毒性、神经毒性、免疫毒性以及肝毒性等。肝脏作为外源化合物代谢最主要的器官,也是TBT攻击的主要靶器官之一。TBT现有的研究主要停留在细胞形态层面,而在基因和蛋白质水平展开的研究非常少,因此TBT诱导肝毒性的分子机制仍不清楚。本研究选用人正常来源的肝细胞HL7702,运用毒物基因组学技术对TBT影响肝细胞的基因表达水平进行研究。方法:1.用MTT法检测不同浓度的TBT(0、2、4、6、8、10μM)暴露2 h后对细胞增殖的影响。2.HL7702细胞暴露于TBT后提取总RNA,并用Nano Drop核酸检测仪和1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。3.Affymetrix表达谱芯片分析TBT对全基因组转录水平的影响。4.用SAM软件筛选对照组和TBT暴露组之间的差异表达基因,要求FDR5%且实验组基因表达水平/对照组基因表达水平2。5.用GO数据库进行基因注释和生物学解释,用DAVID数据库进行基因功能聚类和信号通路分析。6.芯片研究中发现的13个凋亡相关差异表达基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。7.通过流式细胞术,用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分析HL7702细胞暴露于不同浓度的TBT 2 h后的细胞凋亡率。8.用IPA软件进行上游信号分析、下游信号分析,构建TBT诱导细胞凋亡的信号通路图。结果:1.根据MTT结果,选取0、2、6、10μM的TBT染毒开展后续实验,并把2、6、10μM分别作为低浓度、中浓度和高浓度。2.根据芯片实验,细胞暴露于低浓度、中浓度和高浓度的TBT后分别出现770,1028,1221个差异表达基因。3.信号通路分析结果表明,细胞凋亡是TBT肝毒性的主要原因。4.对芯片筛选得到的13个凋亡相关基因用q RT-PCR进行验证,变化趋势与芯片结果一致。5.流式细胞术表明,低浓度的TBT暴露后细胞的凋亡率并没有发生改变,但是中、高浓度的TBT暴露后,凋亡细胞数量明显增加,并呈现剂量-效应关系。6.IPA软件提示HSP家族、激酶和TNF受体等共同介导了TBT诱导的细胞凋亡。7.HL7702细胞暴露于TBT后,p53基因信号通路、整合素信号通路、微丝细胞骨架调控也在通路分析时被富集,说明这些信号通路也可能参与了TBT诱导的肝毒性。结论:全基因组表达谱芯片显示诱导细胞凋亡是TBT肝毒性作用的主要原因,死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径全部参与了TBT诱导的细胞凋亡。
【学位授予单位】:宁波大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R114

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