基于Cas9质粒的重构及微藻电转化条件的研究

【摘要】：小球藻繁殖迅速,易培养,可作为生物反应器的模式菌株;藻中含有的多种营养物质和活性成分,可以具有提高人体免疫力、具有抗氧化、抗肿瘤等功能。为了提高微藻生物质生产的能力或者获某些特异性能,基因突变或基因编辑是目前最为经济和迅速地研究方法,其中CRISPR/Cas9系统因具有操作简单,精确度高等优势,成为小球藻基因编辑体系中研究重点。目前通过电转化将带有特定基因工程选择标记的Cas9质粒,转化到小球藻中尚未见报道。本论文将通过优化电容、电压、电阻等电转化条件,探索带有G418抗性的Cas9质粒导入小球藻中的方法,以便建立微藻的电转化体系。首先,利用BG11培养基,通过平板划线法从河北的4条河流水域中筛选得到4株微藻。通过建立镜检并结合18S rDNA序列选择其中的一株球藻作为实验藻株。测定了实验藻株680nm处的OD值并绘制生长曲线,观察其对不同浓度的G418、氨苄氯霉素、卡那霉素和潮霉素的敏感性,确立了G418可以作为为小球藻基因工程筛选标记。其次选取了含NEO启动子(含有G418抗性)基因的植物双元表达载体pBI121质粒,针对该质粒的NEO启动子基因序列设计了带有HindIII酶切位点的引物,并成功将该序列与带G418的pRGE31构建重组质粒。利用响应面的方法得到适合小球藻的最优电转化条件。结果表明当电压400v、电阻200Ω、电容25μF时,成功将重组质粒pRGE31转入小球藻中。综上所述,本研究成功构建了带有G418抗性的Cas9质粒;确定了电转化体系,将重组质粒pRGE31成功转化到小球藻中。为小球藻高效利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑,实现遗传育种及产业应用提供可靠的实验基础。