青钱柳悬浮培养细胞三萜酸积累、分离鉴定及其降糖机制研究

【摘要】：青钱柳(Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk)为我国特有的胡桃科青钱柳属珍稀濒危植物,零星分布于我国南方各省,可用于保健食品、医药、园林绿化、工业用材等多个领域。研究表明,青钱柳叶含三萜、黄酮、多糖、皂苷及各种微量元素等多种功能活性成分,是具有很高利用价值的天然保健食品资源,但其繁育十分困难,资源稀缺严重制约了其开发利用。本文研究了青钱柳细胞悬浮培养及其三萜酸积累规律,从悬浮培养细胞中提取分离出了主要的三萜酸并进行了结构鉴定,同时对其降糖作用效果及机制进行了研究,旨在探索以青钱柳细胞悬浮培养方式生产三萜酸类降糖功能因子的可行性,为深度开发和利用青钱柳资源、生产三萜酸类降糖功能食品提供理论依据。 以青钱柳无菌幼叶诱导愈伤组织,通过长期的筛选和继代培养,获得了疏松易碎、生长旺盛、适合于悬浮培养的优良愈伤组织,转入悬浮培养后,再经反复的筛选、继代和优化培养条件,建立了良好的细胞悬浮培养体系。该培养体系最佳继代时间为接种后第8天,最大细胞干重产量出现在第10天,最高总三萜酸产量出现在第14天。在保持MS培养基中总氮源浓度及铵态氮和硝态氮比例的同时,将磷酸盐、钙离子和镁离子浓度分别调整至1.875 mmol·L-1、2 mmol·L-1和2 mmol·L-1,可获得较高的总三萜酸产量。以三氯化铈和水杨酸对悬浮细胞进行诱导,总三萜酸产量分别可提升35.70%和22.31%。悬浮培养细胞总三萜酸、熊果酸和齐墩果酸产量分别可达1179.85 mg·L-1、443.64 mg·L-1和159.00 mg·L-1。 本文首次对青钱柳悬浮培养细胞中的主要三萜酸进行了提取、分离和鉴定。以乙酸乙酯为提取溶剂超声辅助提取悬浮细胞总三萜酸,得率高且杂质少,提取物易于纯化,优化后的主要工艺参数为提取时间40 min、提取温度50℃、料液比1：10,优化条件下总三萜酸提取得率达5.56%。经大孔树脂吸附、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶层析、半制备高效液相色谱和重结晶等分离纯化,从总三萜酸粗提物中获得了5个单体三萜酸,经HPLC、TLC、RRLC-TOF/MS、1H NMR、13C NMR和DEPT等检测分析,化合物Ⅰ-V分别被鉴定为熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸、2αl-羟基熊果酸、2a-羟基齐墩果酸,其中白桦脂酸和2α-羟基齐墩果酸是首次在青钱柳中得到分离、鉴定。 本文以3T3-L1脂肪细胞为模型,在前脂肪细胞、成熟脂肪细胞、胰岛素抵抗脂肪细胞多个层次上进行了青钱柳悬浮培养细胞三萜酸降糖作用效果研究。试验结果表明：(1)TTA(总三萜酸)、UA(熊果酸)、OA(齐墩果酸)、BA(白桦脂酸)、CA(2α-羟基熊果酸)对3T3-L1前脂肪细胞增殖没有促进作用,2.5μg·mL-1 MA(2α-羟基齐墩果酸)有明显的促进作用；(2)TTA、UA、OA、BA对前脂肪细胞葡萄糖消耗没有促进作用,而CA、MA在浓度为2.5至5μg·mL-1时有促进作用,并且在没有胰岛素刺激的情况下也能显著提高葡萄糖消耗；(3)5μg·mL-1的TTA、UA、OA能极显著地促进前脂肪细胞分化,而5μg·mL-1的CA明显地抑制分化,BA和MA则基本无影响；(4)TTA、UA、OA、CA和MA均对成熟脂肪细胞的葡萄糖消耗具有较好的促进作用,且在无胰岛素存在的条件下也能提升葡萄糖消耗,表明三萜酸促进成熟脂肪细胞葡萄糖消耗可能存在与Ros(罗格列酮)不同的作用机制；(5)TTA、UA、MA能防止Dex(地塞米松)所诱导的胰岛素抵抗的形成,OA和CA虽然不能防止胰岛素抵抗形成但能减轻抵抗的程度,而BA对胰岛素抵抗的形成没有影响；(6)TTA和UA能改善已经形成胰岛素抵抗细胞的抵抗状态,具有较好的胰岛素增敏作用,MA、OA、CA也有一定的增敏效果,但BA对抵抗状态没有改善作用；(7)各三萜酸在合适的浓度下,均能显著地减少胰岛素抵抗脂肪细胞培养上清液中的FFA(游离脂肪酸)的含量,这也可能是三萜酸改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖消耗的作用机制之一。 在全面研究三萜酸降糖作用效果的基础上,选择了效果较好的TTA 7.5μg·mL-1组、UA 5μg·mL-1组、OA 5μg·mL-1组和MA 5μg·mL-1组进行进一步的降糖机制研究,通过检测三萜酸对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、CAP、Glut4、Resistin和IRS-1五个胰岛素信号传导相关关键靶点的mRNA表达水平,初步探索其作用的分子机理。试验结果表明：(1)UA可能通过两条途径增强胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性、促进葡萄糖消耗：一是上调PPARγ及其下游基因Glut4 mRNA的表达,二是提高IRS-1 mRNA的表达；(2)OA可能是通过下调Resistin mRNA的表达来发挥降糖作用；(3)MA可能通过提高胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞CAP和IRS-1 mRNA的表达来增强胰岛素敏感性、促进葡萄糖消耗,虽然MA没有表现出促进PPARγmRNA表达的活性,但还是明显促进了CAP mRNA的表达,提示CAP的表达除受PPARγ调控之外还可能存在其它调控途径；(4)TTA为各三萜酸的混合物,其降糖作用的效果和机制基本上是各三萜酸作用的综合体现,一是通过促进PPARγmRNA的表达来提高其下游CAP、Glut4 mRNA的表达；二是上调IRS-1 mRNA的表达；(5)青钱柳三萜酸在改善胰岛素抵抗、促进葡萄糖消耗上存在与Ros不一样的作用机制。 综上所述可得出如下结论：(1)青钱柳悬浮培养细胞中含熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸、2α-羟基熊果酸、2α-羟基齐墩果酸五种主要的三萜酸；(2)青钱柳细胞悬浮培养可用于熊果酸、齐墩果酸等三萜酸的生产；(3)青钱柳悬浮培养细胞三萜酸具有较好的降糖作用效果；(4)青钱柳悬浮培养细胞三萜酸可通过提升PPARy、CAP、Glut4、IRS-1 mRNA的表达、下调Resistin mRNA的表达水平来实现降糖作用。

【关键词】：青钱柳 三萜酸 分离 鉴定 降糖 分子机制 3T3-L1脂肪细胞 植物细胞培养
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：X173
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