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槲寄生中生物碱与黄酮类化合物的提取、纯化及黄酮类化合物的生物活性研究

李俶  
【摘要】: 槲寄生为桑寄生科(Loranthaceae)植物槲寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai)的干燥茎、枝。槲寄生是我国常见的传统中草药,使用记载的历史始于秦汉时期,古代称桑上寄生,为《神农本草经》上品。但槲寄生V.coloratum(Kom.)Nakai和桑寄生Loranthus parasiticus(L.)Merr.用名较为混乱,而且由于两者功效相似及用药习惯的沿袭,临床上两者一直是混用的。从《名医别录》到《本草纲目》的一些著作中,关于桑上寄生一项大都是指槲寄生,直至近代。《中国药典》1985年版已将桑寄生和槲寄生分列开来,在其中仅收载槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai一种。我国北方诸省产的槲寄生品种单一,均为药典记载的槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai。它是以干燥的带叶茎枝入药,主要功效在于祛风湿、补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等。现代药理研究发现,槲寄生具有抗肿瘤、抑菌、抗衰老以及免疫调节等功效。 槲寄生的主要有效成分是黄酮类化合物,生物碱、粘毒素及凝集素等,但临床应用主要还是以本草或者粗提物的形式为主,影响了槲寄生的有效利用,使得我国的资源优势无法得到充分的发挥应用,故提取分离纯化槲寄生的有效成分并明确其化学结构显得尤为重要。目前,对槲寄生的研究主要集中在有关抗癌蛋白活性成分,即槲寄生毒肽和凝集素及其它们的作用机理。对槲寄生中的其它化学成分及其生物活性的研究报道比较少,到目前为止,我国北方产的槲寄生中的生物碱和黄酮类化合物的提取、分离、纯化以及产品活性的研究未见有系统的报道。因此,对我国北方产的槲寄生中的黄酮和生物碱等成分展开研究,旨在可丰富槲寄生的应用范围,为充分利用我国北方的这一丰富药材资源,开发我国自主知识产权的新药提供科学依据。 本文对槲寄生主要的活性成分黄酮及生物碱均做了较为详细的研究,为槲寄生综合利用和新药开发的研究奠定了相关的理论和应用基础。主要研究内容与所得结果如下: 1.应用现代食品分析技术,对槲寄生的基本营养成分进行了较为全面的分析。结果如下(g/100g,干重):水分含量为9.03,灰分含量为6.07,粗纤维含量为19.65,脂肪含量为14.69,总糖含量为5.53,还原糖含量为1.98,蛋白质含量为11.29,维生素E含量为127.63μg/g。采用ICP-AES法同时测定槲寄生的微量元素,结果表明,槲寄生中含有丰富的K、Ca元素,Na、Mg的含量也相对丰富;一次煎煮液和二次煎煮液中的微量元素含量变化不大,故就微量元素而言,完全可以只煎煮一次得槲寄生煎煮液即可。 2.在对槲寄生的有效成分生物碱的研究中,采用重量法测定其含量,研究比较了酸水回流提取法、超临界CO_2萃取法、超声波辅助浸提法等不同提取方法,并对实验条件进行了正交设计试验优化,结果表明:超声波辅助浸提法中总碱的得率高于超临界CO_2萃取和传统的酸水提取法。通过正交试验确定提取的最佳工艺参数为:乙醇体积分数90%,超声时间30min,固液比1∶20,总碱的提取率可达1.73%。相比之下,超声波辅助浸提的方法简单易行,不失为一种有效的提取方法。 3.对总生物碱作了进一步分离纯化的探讨,与离子交换相比,大孔吸附树脂更适合于本体系生物碱的分离与纯化。通过对四种不同极性的大孔吸附树脂的筛选,优选出D101型大孔吸附树脂。在优化条件(上样液浓度0.288mg/mL,流速控制在4BV/h和pH10)下,总生物碱吸附率可达到3.15mg/g干树脂以上;在解吸优化条件(乙醇/水为50/50,解吸液流速控制在2BV/h)下,总生物碱解析率达到94%。 4.重点对槲寄生中主要活性成分黄酮进行了研究。采用铝盐显色可见分光光度法测定其含量,回收率为99.73%。研究比较了传统提取法、超临界CO_2萃取法、超声波辅助浸提法等不同提取方法对槲寄生总黄酮的提取,并进行了正交设计和二次旋转回归设计试验优化,对试验结果进行了统计分析或响应面分析,得到其最高得率和最优条件组合。实验结果发现,超声波辅助提取优于常规提取方法,其最佳提取条件为乙醇浓度84.72%、固液比1∶32、超声时间32.78min,在此条件下的黄酮得率为1.32%。 5.在获取黄酮粗提液后,对其纯化方法进行了探索,筛选出AB-8大孔吸附树脂对槲寄生黄酮进行分离纯化,并对AB-8树脂解吸剂的选择、上样浓度和pH值、进样速度、洗脱速度进行了研究,结果表明:当初始样液浓度为5.2mg/mL,pH值4左右时,以4BV40%乙醇作洗脱剂,上样速度2BV/h,洗脱流速1BV/h为最佳纯化条件。纯化后的样品纯度由原来的12.16%提高到69.63%,提高了5.73倍,回收率可达81.36%。 6.经显色反应和紫外光谱扫描后,初步鉴别槲寄生中黄酮类化合物的类型可能为黄酮和黄酮醇。 7.通过利用AB-8型大孔吸附树脂对提取后的总黄酮进行分步梯度洗脱,总黄酮得到了初步的分离,10%~30%乙醇洗脱液中的化合物比较多,彼此间分离效果不佳,但40%~60%乙醇洗脱液中的化合物有所减少,且分离效果尚可。对其中40%~60%乙醇洗脱液中部分黄酮类化合物进一步分离研究,采用制备型高效液相色谱,改变了两次的流动相体系,分离得到了黄酮类化合物A和B。与其他方法相比较,省时,省力,方便快捷。该两化合物分别经UV、IR、~1H NMR/~(13)C NMR以及MS相关波谱鉴定,A为高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4’-O-β-D-芹菜糖甙,B可能为高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙。 8.通过四种不同体系(油脂过氧化、DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基)研究了槲寄生黄酮的抗氧化性能。结果表明:在油脂体系中,一定浓度的槲寄生黄酮提取物对豆油的抗氧化作用强于一定浓度的Vc和BHT,与增效剂柠檬酸、Vc有良好的协同作用,且Vc的增效作用强于柠檬酸;在自由基体系中,采用分光光度法和化学发光法测定了纯化样品清除DPPH·、·OH、O_2~-·的能力。结果显示,槲寄生清除自由基性能良好,清除率与浓度成正量效关系,清除能力大小关系为:DPPH·>·OH>O_2~-·。 9.通过高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙-4’-O-β-D-芹菜糖甙对抗血小板活化因子(PAF)的作用,首次发现该化合物对PAF诱导的血小板聚集有显著抑制作用,并且呈剂量依赖关系。


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