pEGFP-N_2-VEGF基因转染的骨髓间充质干细胞与PLGA材料相容性

【摘要】： 目的:探讨转染pEGFP-N2-VEGF(携带增强型绿色荧光蛋白的血管内皮生长因子基因)后的骨髓间充质干细胞与PLGA(聚乳酸/乙醇酸共聚物)材料的相容性。 方法:1、原代培养以密度梯度离心法获得兔骨髓间充质干细胞,常规换液、传代、冻存与复苏,流式细胞仪检测其细胞周期;2、将含pEGFP-N2-VEGF基因质粒的大肠杆菌菌种摇菌过夜,以无内毒素大提试剂盒提取质粒,用紫外分光光度法及琼脂糖电泳检测其浓度及纯度;3、用脂质体包埋法将pEGFP-N2-VEGF基因转入骨髓间充质干细胞,PCR检测转染效果,免疫组织化学观察是否有蛋白表达;4、同法转染接种于PLGA种植模型上的骨髓间充质干细胞,分别利用荧光显微镜及扫描电镜进行观察;5、MTT(四唑盐比色实验)检测转染pEGFP-N2-VEGF前后细胞活力,分4组:①骨髓间充质干细胞组、②转染pEGFP-N2-VEGF骨髓间充质干细胞组、③骨髓间充质干细胞+PLGA组、④转染pEGFP-N2-VEGF骨髓间充质干细胞+PLGA组。 结果:1、原代骨髓间充质干细胞呈细长梭形,克隆样生长;多次传代后出现老化现象,细胞变扁平。流式细胞术示第二代的骨髓间充质干细胞90%以上的细胞都处于G0/G1期。而第六代骨髓间充质干细胞G0/G1期约占80%左右。2、紫外分光光度法示摇菌后获得的pEGFP-N2-VEGF质粒溶度为1380μg/ml ,琼脂糖电泳可见相应条带;3、pEGFP-N2-VEGF基因转入骨髓间充质干细胞后,PT-PCR检测可有特征性的扩增条带出现,与DNAmark相比较,条带位置相符;48h后行细胞免疫化学染色,VEGF抗体反应呈阳性。4、转基因后可以在荧光显微镜、扫描电镜下较好的观察细胞与材料之间的相互作用;5、MTT示转染前后4组各孔光吸收值在492nm波长时分别为:0.309±0.113、0.350±0.176、0.295±0.112、0.336±0.172;在629nm波长时依次为0.104±0.036、0.121±0.050、0.085±0.035、0.102±0.053,①组与②组、③组与④组在统计学上都无统计学意义(p0.05)。 结论:1、密度梯度离心法可获得足够数量较强分化潜能的骨髓间充质干细胞; 2、骨髓间充质干细胞转染pEGFP-N2-VEGF基因后可在分子和蛋白层次获得表达;3、转染pEGFP-N2-VEGF基因可作为标记骨髓间充质干细胞的一种有效方式,为动态观察细胞与材料之间的相互作用打下了一定的基础;4、转染pEGFP-N2-VEGF基因不影响骨髓间充质干细胞在PLGA材料上的活力,为血管组织工程研究提供了一种新的手段。