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《南昌大学》 2010年
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嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建及亲环蛋白基因的序列分析

谢凯  
【摘要】: 池蝶蚌(Hyriopsis Schlegeli)原产于日本滋贺县的琵琶湖,属软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属,与我国三角帆蚌为同属不同种。池蝶蚌无论形态、生长速度、产量、成活率、育珠能力皆优于其它淡水育珠蚌,更具有经济优势,因而国内已大力发展池蝶蚌作为我国的重要育珠对象之一。本研究构建了经过嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA全长文库并对部分序列进行了序列分析,并重点对免疫相关基因亲环蛋白(Cyp A)进行了较详细的序列分析。主要结果如下:1.利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)诱导处于旺盛生长期(四龄)的池蝶蚌14h,采用Trizol试剂提取诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA。根据Creator SMART试剂盒用户手册,逆转录后,用LD-PCR合成双链cDNA,并逐步构建成池蝶蚌血细胞的全长cDNA文库。本文库为首次成功构建的淡水贝类池蝶蚌血细胞全长cDNA文库。原始文库的滴度为4×106cfu/cm3,重组率为90%,扩增后文库的滴度为3.55×109pfu/ml。 2.从文库共随机测序102个样品,所得双向测序结果去除载体,拼接,并多序列比对去除重复序列后,余59条已知功能序列,其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp,最大长度为2153bp,平均大小608.6 bp,表明插入片段大小理想。已知基因根据其功能可分为以下几大类:基础代谢类基因,细胞凋亡,细胞分裂调节、蛋白质的装配、修饰与降解,DNA合成、转录、翻译及重组相关基因,核糖体基因和免疫相关基因。 3.从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析,池蝶蚌Cyp A基因全长1229个碱基,其在53-547位存在一个长495 bp的开放阅读框,编码164个氨基酸。其起始密码子是atg,终止密码子是taa。HsCypA序列还包括52bp的5'非编码区(untranslated region,UTR),682bp的3'UTR,和29 bp的poly(A)尾,没有明显的加尾信号。ORF编码区蛋白的分子量为17.26 kDa,理论等电点PI=8.9。对Cyp A氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模,同时构建了其系统进化树,分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。 本研究为课题组基础性工作,其研究成果将为大规模筛选文库、发现新的功能基因提供有效的平台,为免疫相关特定基因的研究提供了较好的依据。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S917.4

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