收藏本站
《南昌大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

RNA干扰抑制BMP-2基因表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭的影响及机制

吴建兵  
【摘要】: 第一部分肝癌SMMC7721细胞骨形态发生蛋白及其受体表达的研究 目的:检测细胞骨形态发生蛋白2、3、4、5、6、7(BMP-2、3、4、5、6、7)及其Ⅰ型受体(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)在肝癌SMMC7721细胞中的表达。 方法:采用RT-PCR检测在肝癌SMMC7721细胞中BMP-2、3、4、5、6、7及其Ⅰ型受体(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)mRNA水平的表达。采用Western blot检测BMP-2、6及BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-Ⅱ在正常肝细胞和肝癌SMMC7721细胞中蛋白水平表达的差异。 结果:1、RT-PCR检测结果显示在人肝癌SMMC7721细胞中,BMP-2基因呈高表达、BMP-6基因呈中等程度表达(相对光密度比值ROD分别为0.81±0.12、0.52±0.13),而BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-7基因仅见微量表达,BMPs受体BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ均见不同程度表达(ROD分别为0.62±0.11、0.73±0.19、0.79±0.22);2、Western blot检测结果提示正常肝细胞能表达BMP-2、BMP-6,但其表达量明显低于肝癌SMMC7721细胞,二者相比较差异有非常显著统计学意义(P0.01);3、Western blot检测结果提示,肝癌SMMC7721细胞能表达BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ,且其表达量与正常肝细胞相比无显著差异(P0.05)。 结论:1、人肝癌SMMC7721细胞中,BMP-2基因呈高表达、BMP-6基因及BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ呈中等程度表达。2、BMP-2、BMP-6在肝癌SMMC7721细胞中表达量明显高于正常肝细胞,BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ在肝癌SMMC7721细胞表达量与正常肝细胞相仿。 第二部分BMP-2在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义 目的研究BMP-2基因在原发性肝癌及正常肝组织中的表达,结合原发性肝癌的临床病理因素,探讨BMP-2基因与原发性肝癌临床病理因素之间的关系。 方法:1、采用RT-PCR方法检测BMP-2基因在30例肝癌组织和10例正常肝脏组织中mRNA水平的表达。2、采用RT-PCR、Western blot检测BMP-2基因在不同临床病理参数的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平,并分析其与临床病理参数之间的关系。 结果:BMP-2基因在肝癌组织中呈高表达,而在正常肝组织的表达则明显减弱(P0.01),BMP-2的表达与临床分期、病理分级、远处转移密切相关(P0.01);而与患者年龄、病理分型、AFP以及是否合并肝硬化等因素无明显相关(P0.05)。 结论:BMP-2在原发性肝癌中的表达显著高于相应的正常肝组织中的表达,提示BMP-2的表达是原发性肝癌的重要特征,BMP-2的表达与原发性肝癌的恶性生物学行为密切相关。 第三部分siRNA抑制肝癌SMMC7721细胞BMP-2基因表达的研究 目的:探讨siRNA干扰对肝癌SMMC7721细胞BMP-2基因表达的影响。 方法:设计并合成针对BMP-2的3个siRNA分子序列。分为6组:Ⅰ组为正常对照组(未经转染的细胞);Ⅱ组为空白对照组(只转染脂质体,无特异性siRNA);Ⅲ组为阴性对照组(转染非特异性siRNA);Ⅳ~Ⅵ组为转染组(分别转染BMP-2-siRNA-A、BMP-2-siRNA-B及BMP-2-siRNA-C)。阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,应用RT-PCR和Western blot检测细胞中BMP-2在mRNA水平和蛋白水平的变化。 结果:正常对照组、空白对照组、阴性对照组以及BMP-2-siRNA-A转染组、BMP-2-siRNA-B转染组、BMP-2-siRNA-C转染组条带经光密度测定、计算相对光密度比值ROD分别为0.89±0.11、0.93±0.12、0.92±0.14、0.65±0.08、0.32±0.07、0.55±0.07,各组进行比较,可见3个转染组细胞BMP-2表达均明显低于其他对照组(P0.05)。其中,BMP-2-siRNA-B转染组干扰效果最好,mRNA表达最低,其表达的相对值由(0.92±0.14)降至(0.32±0.07)(P0.01),而正常对照组、空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05),BMP-2-siRNA-A转染组、BMP-2-siRNA-B转染组、BMP-2-siRNA-C转染组间差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果显示,BMP-2-siRNA-B组转染后干扰效果最好,BMP-2蛋白表达量的相对灰度值RGS明显下调(0.37±0.10)与BMP-2-siRNA-A, BMP-2-siRNA-C组相比较,差异有显著意义(P0.05),而正常对照组、空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义。Western blot检测结果与RT-PCR一致。 结论:siRNA-BMP-2能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的BMP-2表达,以BMP-2-siRNA-B作用最为显著。 第四部分siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭的影响 目的:探讨siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭的影响。 方法:本研究共分三组:1、空白对照组(SMMC7721-nontransfection,细胞不加转染试剂);2、阴性对照组(SMMC7721-siControl,,转染非特异性siRNA);3、实验组(SMMC7721-siBMP-2,转染BMP-2 siRNA)。用MTT检测、流式细胞仪、平板黏附模型、划痕“愈合”模型以及Matrigel体外侵袭实验等方法观察三组细胞增殖、凋亡以及黏附、迁移、侵袭能力的改变。 结果:1、MTT法检测结果显示转染24小时后,SMMC7721-siBMP-2组SMMC7721细胞增殖水平与空白对照组和阴性对照组比较无显著性差异(P0.05),而48小时及72小时后SMMC7721细胞增殖水平明显降低。(P0.05)。流式细胞仪分析siBMP-2转染48小时后,SMMC7721-siBMP-2组G0/G1期细胞(59.30%)较空白对照组(32.35%)和阴性对照组(31.08%)细胞明显增加(P0.05);S期细胞(22.39%)较空白对照组(35.51%)和阴性对照组(38.32%)细胞明显减少(P0.05),细胞凋亡率(16.5%)较空白对照组(1.75%)和阴性对照组(1.49%)细胞明显增加(P0.01)。2、平板黏附模型实验提示SMMC7721-siBMP-2组细胞黏附能力较其它两组明显降低(P0.01)。细胞划痕实验结果显示细胞划痕宽度分别为SMMC7721-siBMP-2组65.8±5.3μm,空白对照组36.6±4.0μm,阴性对照组34.1±5.1μm,提示SMMC7721-siBMP-2组细胞迁移能力显著降低,其细胞划痕宽度与其它两组相比较,差异有显著意义(P0.01)。Matrigel体外侵袭实验(transwell侵袭小室模型)结果显示SMMC7721-siBMP-2组、空白对照组和阴性对照组细胞穿膜数分别为11.5±2.0、33.5±3.1和35.7±3.4,提示BMP-2-siRNA沉默BMP-2基因后,肝癌SMMC7721细胞的穿膜数明显降低,即细胞侵袭能力明显降低,与空白对照组、阴性对照组细胞比较差异有统计学意义(P0.05)。 结论:通过siRNA抑制BMP-2基因的表达,在体外可以显著抑制肝癌SMMC7721细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。 第五部分siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭影响的机制 目的:探讨siRNA抑制BMP-2表达对肝癌SMMC7721细胞体外增殖和侵袭影响的机制。 方法:用BMP-2-siRNA转染肝癌SMMC7721细胞48h后,用Western blot检测p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表达水平;分别用RT-PCR、Western blot及明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9、E-Cad以及uPA的表达水平及活性。 结果:RT-PCR和Western blot显示BMP-2-siRNA转染肝癌SMMC7721细胞48之后,p-ERK蛋白表达水平明显降低,p-JNK、p-p38蛋白表达水平无明显变化。MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达均显著下调,明胶酶谱分析显示细胞分泌活性形式的MMP-2、MMP-9也明显减少。E-CadmRNA和蛋白表达均明显上调,而uPAmRNA和蛋白表达则无明显变化。 结论:BMP-2-siRNA抑制肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭能力可能是通过MAPK/ERK信号传导通路下调MMP-2、MMP-9和上调E-钙粘蛋白的表达得以实现,而与MAPK/JNK、MAPK/p38信号传导通路和uPA表达无关。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.7

免费申请
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 Pisit Tangkijvanich;Varocha Mahachai;Pongspeera Suwangool;Yong Poovorawan;;Gender difference in clinicopathologic features and survival of patients with hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2004年11期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 唐昭军;肖纳新;;caveolin-1、P53及MMP-2在骨肉瘤中的表达及其意义[J];安徽医药;2009年09期
2 王军,相丽,阎丽平,付海波,罗兵;基质金属蛋白酶组织抑制物-1 mRNA在胃癌组织中的表达[J];青岛大学医学院学报;2003年01期
3 郭玉芳;梅红;张丽红;刘巍;郑贤红;李一雷;;人乳腺癌组织活化型MMP-2的分布及意义[J];吉林大学学报(医学版);2006年01期
4 ;Cancer Immunotherapy of Targeting Angiogenesis[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年03期
5 ;Role of Epstein-Barr Virus Encoded Latent Membrane Protein 1 in the Carcinogenesis of Nasopharyngeal Carcinoma[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年03期
6 郭丹;黄佳祎;印国兵;孙治君;;骨形态发生蛋白在乳腺癌增殖、转移中作用的初步筛选[J];重庆医学;2010年07期
7 陈艳华;;罗格列酮对人结肠癌细胞HT-29生长的影响[J];当代医学;2011年03期
8 王迎春;李玉兰;;基质金属蛋白酶-2及其组织型抑制因子在肝细胞癌浸润转移中的作用[J];中国医师杂志;2006年09期
9 李卉;姜孝芳;李惠武;;食管癌发生早期相关基因研究进展[J];地方病通报;2008年04期
10 王冬梅;郭洪;陈雪丹;官兴颖;刘丹;白云;;基质金属蛋白酶8在食管鳞癌中的表达及其临床意义[J];第三军医大学学报;2011年05期
中国重要会议论文全文数据库 前7条
1 张宗尧;张徐祥;杨柳燕;;微囊藻毒素MC-LR 270d暴露对小鼠肝脏损伤以及MMP-2/-9表达的影响[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
2 曾林;孙岩松;杨晓;王冬平;胡仲明;曹永成;丁吉元;;p21~(HBsAg/HBsAg)转基因小鼠肝癌MMP-2蛋白的表达及意义[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
3 梁雄利;李子孝;陈宝师;刘福生;江涛;;人脑胶质瘤中MMP-9表达与纤维束损害的相关性[A];中国水利电力医学科学技术学会临床医学专业委员会外科专业、护理专业2007年会论文汇编[C];2007年
4 喻明霞;牛麟;王晶;尹丙娇;姜小丹;冯玮;李卓娅;;TM-TNF-α单克隆抗体体内外抗肿瘤活性的研究[A];2008年中国病理生理学会第十一届肿瘤和第十二届免疫专业委员会学术会议论文集[C];2008年
5 李荀;李亚林;尹文刚;徐文方;;以Ⅳ型胶原酶MMP为靶点的抗癌药物研究[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年
6 孙保存;赵秀兰;孙涛;车娜;孙丹;赵楠;董学易;古强;;Twist1增强基质金属蛋白酶活性促进肝癌转移[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
7 刘友章;弓淑珍;黄晓燕;;胃炎Ⅰ号对大鼠胃癌前病变组织MMP-7mRNA、MMP-9AmRNA表达的影响[A];2009年中华中医药学会内科分会全国中医内科临床科学研究专题研讨会论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王巍;Nup107和claudin23在转移性胰腺癌中的作用及分子机制的初步研究[D];中国医科大学;2010年
2 丁卫民;肺癌支气管灌洗液MMP-7、Survivin mRNA的表达及临床意义[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2010年
3 费晨;基质金属蛋白酶在痘病毒感染中的作用和表达变化[D];西北农林科技大学;2010年
4 陈剑秋;TIP30通过OPN调控喉鳞状细胞癌增殖及转移的研究[D];第二军医大学;2011年
5 王慧娟;pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞诱导向心肌分化[D];河北医科大学;2011年
6 王立洪;肿瘤标志物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)与钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能研究[D];北京协和医学院;2011年
7 田相国;钙结合蛋白S100A4在胆管癌中的表达及其影响胆管癌侵袭转移的机制研究[D];山东大学;2011年
8 赵忠芳;普萘洛尔治疗血管瘤分子机制的初步研究及临床应用[D];新疆医科大学;2011年
9 关玉娟;乳岩宁与三苯氧胺联合抗乳腺癌作用及其机制的研究[D];辽宁中医药大学;2011年
10 宋晓敏;分泌型热休克蛋白90α在肿瘤发生和转移中的作用机理[D];清华大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高庆;MMP-2、MMP-9、TIMP-2在人脑胶质瘤中的表达及意义[D];郑州大学;2010年
2 张鹏;uPA、uPAR、PAI-1及maspin在宫颈癌组织中的表达及意义[D];郑州大学;2010年
3 李永梅;子宫内膜异位症患者在位内膜中LN及uPAR的检测及其意义[D];郑州大学;2010年
4 刘晓锦;p73、MMP-7及PTEN在人口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[D];郑州大学;2010年
5 郭振营;胃癌中Claudin-1、MMP-2的表达及其意义[D];郑州大学;2010年
6 陈妍琼;KiSS-1、MMP-2和MVD在不同食管病变组织中的表达及其相关性研究[D];郑州大学;2010年
7 潘海邦;胃癌组织中CEACAM6、MMP-9的表达及其临床病理意义[D];兰州大学;2010年
8 刘力峰;饮酒对高脂饮食家兔颈动脉粥样硬化形成的实验研究[D];泰山医学院;2005年
9 丁峰;血清中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在女性乳腺癌诊断中的应用[D];山东大学;2010年
10 刘莹;基质金属蛋白酶13(MMP-13)的色谱纯化与复性研究[D];西北大学;2011年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张盛周;张宏霞;潘飞燕;李朝军;;腺病毒介导的siRNA下调c-Met表达抑制肝癌细胞生长[J];肿瘤防治研究;2008年05期
2 杨永光;李明意;许刚;刘丽娟;戴东;孙丕绛;;Stealth~(TM) RNAi沉默人肝癌细胞Bcl-2表达抑制体外移植瘤生长的研究[J];岭南现代临床外科;2008年03期
3 田雪飞;陶一明;周青;孙靖;郭永良;;RNA干扰诱导肝癌HepG2细胞凋亡对丹参酮ⅡA药物敏感性的影响[J];中西医结合肝病杂志;2009年02期
4 刘宏鸣;刘孟刚;唐春;袁涛;谢斌;陈平;;iASPP干扰RNA促进肝癌细胞凋亡发生的实验研究[J];海南医学院学报;2009年09期
5 陈罡;党裔武;罗殿中;;介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化[J];山东医药;2011年18期
6 张小鹰;吴风云;何金花;廖晓莉;王威;蒋建伟;;靶向增殖细胞核抗原shRNA的构建及其对HepG2细胞增殖与凋亡的影响[J];生物化学与生物物理进展;2010年03期
7 王晓婷;李敏;连晓宁;杨慧翠;曹锴;郭云兰;仲蕾;魏文祥;;RMP在肝癌细胞基因组稳定性和凋亡中的作用[J];中国生物工程杂志;2011年04期
8 郭军;房殿春;范宗江;杨云丽;张树荣;刘苗;;HCCR-2基因沉默后HepG2肝癌细胞形态变化[J];昆明医学院学报;2010年10期
9 郭军;房殿春;杨云丽;杨海捷;范宗江;刘苗;;人子宫颈癌基因-2干扰抑制HepG2肝癌细胞mRNA的表达[J];昆明医学院学报;2009年10期
10 熊震;汤旭东;房殿春;陈婷;余松涛;陈陵;罗元辉;杨仕明;;人肝素酶RNAi序列的筛选及鉴定[J];第三军医大学学报;2007年20期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李敏;杨慧翠;杨吉成;盛伟华;连晓宁;曹锴;魏文祥;;RMP在肝癌细胞基因组稳定性和凋亡中的作用[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
2 李祺福;洪水根;;中国鲎血低分子活性物质对癌细胞增殖分化的调控[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
3 张锦堃;张娟;李军;;树突状细胞与肝癌细胞融合瘤苗的制备和特性[A];第五届全国生物医学体视学学术会议、第八届全军军事病理学学术会议、第四届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2002年
4 张之勇;韩丽辉;孙汶生;;神经营养因子受体TRKB与肝癌细胞BEL7402抵抗失巢凋亡的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
5 金吴东;陈龙华;;mIκBα基因转染肝癌细胞HepG2的放射增敏作用[A];2007第六届全国放射肿瘤学学术年会论文集[C];2007年
6 田德安;;Smac和AIF基因在肝癌细胞中的表达及与细胞凋亡关系的试验研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
7 傅遍红;吴泽志;秦建;;整合素亚单位对肝癌细胞与层粘连蛋白趋化迁移运动的影响[A];渗流力学与工程的创新与实践——第十一届全国渗流力学学术大会论文集[C];2011年
8 王芳;杨富;张玲;徐丹;霍希松;毕海珊;孙树汉;;微小RNA17-5p通过靶基因E2F1激活热休克蛋白27促进肝癌细胞转移(英文)[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
9 施冬云;冯颖;谢飞舟;刘珊林;;缺氧应激对正常肝细胞和肝癌细胞能量代谢通路的不同影响[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集(第一册)[C];2011年
10 毛华;袁爱力;赖卓胜;张振书;张亚力;周殿元;;VEGF诱导肝癌细胞恶性表型及p38MAPK信号通路的调控作用[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 李大庆;我科学家发现肝癌细胞演化和迁移新路径[N];科技日报;2011年
2 贾玉容;Survivin蛋白促进肝癌细胞快速增生[N];中国医药报;2004年
3 江山;小心肝癌细胞“吃”血糖[N];大众卫生报;2005年
4 胡德荣;纳米磁微粒烧死肝癌细胞[N];健康报;2005年
5 徐铮奎;RNA干扰剂即将浮出市面[N];医药经济报;2004年
6 史凤芝 陈英云;砒霜可诱导肝癌细胞“自杀”[N];大众卫生报;2000年
7 记者 张建松;肝癌细胞为何转移[N];新华每日电讯;2000年
8 朱恒顺;山大一项免疫学成果通过鉴定[N];科技日报;2002年
9 张建松;肝癌细胞转移相关染色体被发现[N];中国医药报;2000年
10 李 戎 闫智勇 李文军 张天娥;中医药防治原发性肝癌机理研究进展[N];中国中医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴建兵;RNA干扰抑制BMP-2基因表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭的影响及机制[D];南昌大学;2010年
2 宋关斌;肝癌细胞力学特性及其与细胞周期的关系研究[D];重庆大学;2002年
3 崔恒武;电化学对体外肝癌细胞生物学行为的作用及对肝癌患者免疫功能的影响[D];第二军医大学;2002年
4 刘妍;双特异性抗肿瘤重组腺病毒对肝癌细胞及其模型动物的治疗作用研究[D];吉林大学;2011年
5 黄海燕;表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用[D];吉林大学;2011年
6 李劲东;MCT1、CD147在人肝癌中的表达及其反义RNA表达载体对肝癌细胞的影响[D];中南大学;2010年
7 张弘超;树突状细胞联合多烯紫杉醇对肝癌生物学行为的影响[D];中国医科大学;2008年
8 谭晓虹;P21~(WAF1/CIP1)对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响及其与POLD1基因关系初探[D];广西医科大学;2010年
9 曹献英;纳米羟基磷灰石诱导肝癌细胞死亡的作用靶点及机理研究[D];武汉理工大学;2005年
10 张之勇;肝癌细胞通过Synoikis-like方式抵抗失巢凋亡的研究[D];山东大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡礼仪;多药耐药基因MDR1短发夹状RNA表达质粒的构建与鉴定[D];武汉大学;2005年
2 陆彬彬;人血管内皮生长因子shRNA对肝癌细胞增殖的影响[D];南京医科大学;2006年
3 薛会丽;67LR促进肝癌侵袭转移的分子机制研究[D];福建医科大学;2008年
4 杨辉;抑制促血管生成素-2基因表达对肝癌血管生成的影响[D];遵义医学院;2010年
5 张勇;B7-1基因转染肝癌细胞的实验研究[D];苏州大学;2002年
6 来文;肝癌细胞膜单克隆抗体Hepama-1的质量控制及其放射性标记物的临床前毒理学研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
7 赵航宇;斑蝥酸钠维生素B6联合X射线诱导肝癌细胞HepG2凋亡的研究[D];中国医科大学;2010年
8 沈徐宁;NSC 74859通过抑制STAT3的表达可以增加Cetuximab对肝癌细胞的生长抑制作用[D];浙江大学;2010年
9 张璐;小鼠H22肝癌细胞肺高转移株的建立及其生物学特性的测定和RhoC基因的表达[D];中国医科大学;2010年
10 张晋;视蛋白基因3(opsin3)参与调节肝癌细胞5-Fu耐药性的机制研究[D];南京医科大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026