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《南昌大学》 2010年
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耐受性树突状细胞来源的exosome治疗小鼠免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究

黄祺琦  
【摘要】: 目的:分离纯化耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells, tDCs)来源的exosome(tDex),探索其对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠造血功能的影响及其在免疫调节中的作用。 方法:采用雌性Balb/c小鼠为供体,雌性昆明小鼠为受体。取供体小鼠骨髓细胞,分离单个核细胞。在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入GM-CSF 20ng/ml+VIP 40ng/ml +DXM 10ng/ml进行体外诱导培养;收集上清液,经超速离心分离纯化tDex,Bradford法进行蛋白定量。光镜下动态观察tDCs细胞形态,电镜下观察tDex形态,流式细胞术检测tDCs和tDex CD80、CD86、CD40、CD11c、Fas-L表达。MTT法检测tDex刺激淋巴细胞增殖活性。共120只小鼠随机分为下列各组:1)正常对照组:为正常小鼠不做任何处理;2)模型组:昆明小鼠经X射线亚致死量(7Gy)全身均匀照射后,于4小时内自尾静脉输入Balb/c小鼠的胸腺淋巴结细胞1×106/只;3) tDCs组:制模后当天输注tDCs1×106/只;4)tDex 1组:a:tDex 5ug/只,b:tDex 10ug/只,c:tDex 20ug/只;5)tDex 2组分别于d0,d3,d7天输入tDex 8ug/只。动态观察小鼠外周血细胞变化,小鼠濒死时(或制模后第28天),取股骨行骨髓病理切片观察,计数单侧股骨骨髓有核细胞数,甲基纤维素半固体培养法测定CFU–GM集落数,流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+CD8+、CD3+HLA-DR+、CD4+CD25+、Foxp3+T细胞、Th1/Th2辅助性T细胞的表达,实时荧光定量PCR检测T-bet、GATA-3基因表达。 结果: 1.tDex与tDCs比较,CD11c、CD80、CD86,Fas-L均无显著性差异(P0.05);tDex组CD40、MHC-Ⅱ表达均低于tDCs组(P0.05)。 2.淋巴细胞增殖活性测定:tDCs与tDex对于淋巴细胞均有抑制细胞增殖活性的作用,tDex与tDCs联合使用比单用tDCs抑制作用更加明显(P0.05);单用tDex组内,tDex浓度越高,其抑制作用越强;tDex作用72小时比48小时的抑制活性更强,提示tDex的抑制活性与时间、剂量成正比。 3.输注tDCs组、tDex5ug及第3天输注tDex 8ug组小鼠较模型组造血功能明显改善,制模后第28天生存率较模型组高。与模型组比较,外周血白细胞及血小板数2周后持续上升,单侧股骨骨髓有核细胞数及CFU–GM集落数明显增多(P0.05)。骨髓病理切片显示:骨髓增生活跃,造血细胞增加,可见少量脂肪细胞填充骨髓腔。脾淋巴细胞CD3+CD8+T细胞明显低于模型组, CD4+CD25+、Foxp3+T细胞明显高于模型组、Th1/Th2辅助性T细胞的比值较模型组明显降低,CD3+HLA-DR+差别无显著统计学意义, T-bet/GATA-3基因表达较模型组明显下降(P0.05)。 结论: 1.小鼠骨髓单个核细胞,体外经GM-CSF、VIP、DXM、LPS联合诱导培养生成耐受性树突状细胞(tDCs),经超速离心纯化可获得exosome; 2.tDex与tDCs具有相似的诱导免疫耐受特性; 3.来源于体外培养tDCs的tDex输注免疫介导性再生障碍性贫血小鼠体内,可诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞生成,Th1/Th2和T-bet/GATA-3基因表达比例下降,促进小鼠造血功能的恢复。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R556.5

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