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《天津医科大学》 2011年
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新发现甲状腺激素受体β亚型的研究

赵荣兰  
【摘要】:甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, TRs)属于核受体超家族的成员,由TRa和TRB基因编码。TRa和TRB基因由于选择性剪接或转录起始位置的不同而产生若干同工体(isoform)。主要有TRa1、TRa2、TRa3、TRβ1、TRβ2 TRβ3和截短的TRΔα1、TRΔα2、TRΔβ3等。先前本室在大鼠肝脏发现一个新的TRB的新同工体,它不是又一个截短的TRB亚型(例TRΔβ3),而是一个加长的、带有一个超长的DNA结合域的新亚型,被命名为TRp△(不是TRAp);同时发现了一个新的外显子(exon N)。本文对其进行了继续研究即其来源、生成过程及其若干组织内分布;同时我们又幸运的发现了又一新的同功体TRB2Δ。本文将分成三部分叙述:一、TRp△通过可变剪接生成的蛋白水平论据;二、又一个新发现的TRB同工体(TRβ2Δ)的研究。三、初步探索核受体超家族中其他成员的DBD区是否也存在类似的未被发现的新外显子。 为了深入了解TRβ△剪接方式在蛋白水平的论据,我们截取了TRβ基因外显子3的3’端部分、内含子3-4全长、以及外显子4的5’端的部分序列共约6.4kb的基因组DNA片段命名为TRβ小基因。以含有上述小基因的质粒为模板体外转录pre-mRNA,再利用体外剪接系统(不同的细胞系),进行剪接实验;为了便于检测剪切的蛋白产物,在小基因后分别融合了增强型绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因,利用定点碱基删除改造小基因后进行体外转染实验同时给予T3处理,观测剪接、翻译的变化。RT-PCR显示:TRβ小基因在多种细胞系中被成功转录并剪接成两种转录本;蛋白水平检测:(1)绿色荧光蛋白检视阳性细胞率和荧光素酶活性值在剪接形成外显子3/N/4时均明显高于剪接形成外显子3/4时;(2)T3处理后,剪接形成外显子3/N/4时产生荧光素酶活性值明显高于无T3处理组。因此说明TRB小基因在mRRNA及蛋白水平均以剪接成为外显子3/N/4为主,并且该剪接产物受到其配体的正性调节。 为了进一步了解TRp△在不同组织的表达图式,采用Real-time荧光定量PCR分析TRβΔ、TRβ1及TRβΔ+TRβ1转录本在成年大鼠肝、脑、心肌、肺、肾、脾、骨骼肌及睾丸组织中的含量。结果显示:除睾丸组织外均可检测到TRp△与TRβ1的表达,其中心肌表达量最高,脑组织低表达,并且各组中TRp△的表达量均显著高于TRβ1,并在TRβ1+TRβΔ的和值(sum)中占绝大的比例。 利用PCR方法初步探索到垂体中存在TRβ2的新亚型,全长扩增测序,序列提交Genbank,被命名为TRbeta2Delta (TRβ2Δ, HM043807.1)。Real-time荧光定量PCR分析TRβ2Δ, TRβ2及TRβ2Δ+TRβ2mRNA在成年大鼠垂体组织中的分布特点,结果显示TRβ2及TRβ2Δ在垂体组织中的表达水平大致相等而无明显差别。将新发现的TRβ2ΔcDNA编码序列克隆入融合型原核表达载体pQE-30Xa并进行表达。SDS-PAGE表征表达产物的分子量和相对表达水平,Western-blotting鉴定。TRB2Δ融合蛋白的表达量达到20.21mg/L培养基。目的蛋白占菌体总蛋白的26.3%。重组蛋白含有6×His标签,经Ni-NTA树脂亲和层析纯化的重组蛋白用于放射性配体结合试验(RLBA)和电泳迁移率改变试验(EMSA),结果证实重组TRB2Δ可与T3特异性结合,Ka为2.3±0.11xl0-9L/mol;可单独或与RXR一起结合DNA。为了进一步证明TRβ2Δ不仅能够与其配体及特异性DNA结合,而且结合后可调节靶基因的转录活性,我们构建了pcDNA3.1/TRβ2Δ真核表达载体及含有PAL TRE的pGL3-Promoter报告基因载体,共转染COS-7细胞。结果显示,T3处理组荧光素酶活性明显高于无T3处理组;单独转染含PAL TRE的pGL3-Promoter报告基因载体,由于缺乏与TRE序列结合的TRB2Δ,因此无论T3存在与否与共转染组相比荧光素酶活性值皆低而无变化。说明TRβ2Δ与其配体结合后与TRE结合促进靶基因的转录,进一步证明TRβ2A是一个功能性的TRβ新亚型。 为了探索核受体超家族中其他成员的DBD区是否也存在类似的未被发现的新外显子,本文选择了糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)、雌激素受体(estrone receptor, ER)、雄激素受体(androgen receptor, AR)、维生素D3受体(vitamin D3 receptor, VDR)四个核受体超家族中的成员,通过Genbank分别确定各自的DBD结合区,设计特异性引物去扩增、检测该区是否存在未被发现的新外显子,结果未能在DBD结合区发现类似TR受体中新外显子的存在。因而未能找到加长的同工体。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q57

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