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《天津医科大学》 2008年
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重组腺病毒Adv-AFPsiRNA的构建及其对卵巢癌生长抑制的实验研究

李圃  
【摘要】:[目的]: 鉴于近年来,许多学者和临床医生经过反复研究及临床详尽的观察和检测发现甲胎蛋白在肿瘤发生、发展过程中不仅是一种伴随现象,而是一种与肿瘤细胞生长密切相关的内源性蛋白。并且,在多种疾病(如:原发性肝细胞癌、急、慢性肝炎、睾丸卵巢崎胎瘤、先天性胃肠疾病、混合型的卵巢恶性生殖细胞肿瘤、未成熟畸胎瘤、胚胎癌、内胚窦瘤等)的血清中均可出现AFP的升高。在这些疾病中,虽然已发现血清中AFP水平的变化与非正常的生长表型相关,但仍不能肯定AFP是否与肿瘤发生中导致生长表型改变的直接因素。我室先前对肝癌的研究的结果已表明AFP在肝癌HepG2细胞内蛋白水平与mRNA水平的表达可以被AFPsiRNA显著并特异性地静默。同时还发现AFP静默导致的生长抑制作用并不是主要由于发生了细胞凋亡,而是细胞周期发生G1/S期转变停滞的 结果。 近期虽有关于卵巢生殖细胞瘤表达内源性AFP的报道,但是否其与肝癌有类同情况?且至今尚未见将AFP RNAi技术用于卵巢癌治疗的报道。据此,本研究目的是:首先通过Western blot和Semi-qRT-PCR检测,观察目前常用的,已建株的卵巢癌细胞系及卵巢癌活组织和正常巢癌组织细胞标本AFP表达情况,为后续研究奠定理论基础;然后依据用RNAi技术可静默特定基因,构建重组靶定AFP腺病毒rAdv-AFPsiRNA,在体外观察其对卵巢癌细胞的生长抑制作用,为卵巢癌提供一种新的治疗模式。 [方法]: 在本研究中,我们首先通过Western Blot和Semi-qRT-PCR检测,观察AFP在几种建株卵巢癌细胞系和人卵巢癌活组织及正常卵巢组织标本中蛋白水平及mRNA水平的表达情况。然后利用生物信息技术设计一种以AFP为靶位的shRNA。在化学合成shRNA的cDNA双链后,构建了重组靶定AFP腺病毒载体。构建后,首先用其转染HepG2细胞,对其功能进行了鉴定。然后,用构建的重组靶定AFP腺病毒及rAdv-LacZsiRNA分别转染卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3及ES-2。通过Western blot与半定量RT-PCR分析AFP在癌细胞内蛋白水平及mRNA水平的表达,确定其AFPsiRNA对上述三种卵巢癌细胞的AFP静默的高效性和特异性;用MTT实验和软琼脂克隆形成实验观察了重组靶定AFP腺病毒对卵巢癌细胞的生长抑制作用。 [结果1: 1.体外培养的卵巢癌细胞系AFP表达的结果 Western blot结果表明:①体外培养的卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3及ES-2细胞裂解物均有不同程度的AFP表达,而阴性对照正常皮肤成纤维细胞BJ则无表达;②Semi-RT-PCR结果表明:在上述卵巢癌细胞及卵巢癌活组织标本细胞裂解物均有不同程度的mRNA水平的表达。卵巢癌活组织标本与卵巢活组织标本细胞裂解物mRNA水平的表达相比平均增加了2.3倍。 2.重组靶定AFP腺病毒对卵巢癌细胞生长抑制的实验结果 ①用重组靶定AFP腺病毒rAdv-AFPsiRNA分别感染卵巢癌SKOV3、OVCAR3及ES-2细胞48小时后,通过、vestern blot检测,AFP的表达水平呈明显而特异性的降低,蛋白表达的抑制率分别达64%、28%和69%。而与之相对应的,Adv-LacZsiRNA对于AFP的表达水平则没有明显的影响。 ②用半定量RT-PCR方法验证rAdv-AFPsiRNA对于AFP在mRNA水平上干扰作用。结果显示,在内参β-actin表达量相对一致的情况下,与阴性对照正常皮肤成纤维细胞BJ相比,卵巢癌SKOV3、OVCAR3及ES-2细胞内AFPmRNA水平均有明显降低,抑制率分别为60%、39%、和67%。而与之相对应的,Adv-LacZsiRNA对于AFPmRNA的表达水平则没有明显的影响。 ③通过克隆形成实验,证实了感染重组靶定AFP腺病毒的卵巢癌细胞OVCAR3和ES-2克隆形成数与对照(未感染病毒的相应细胞)相比分别降低了39%和67%。 ④在MTT:细胞活性测定中所用卵巢癌细胞及对照细胞活性均无明显差异。 [结论]: 实验结果表明: 1.体外培养的三株卵巢癌细胞系和卵巢癌活组织标本细胞均有不同程度的AFP蛋白及AFPmRNA水平的表达; 2.AFP在SKOV3、OVCAR3及ES-2细胞内蛋白水平与mRNA水平的表达可被重组靶定AFP腺病毒的AFPsiRNA显著并特异性地静默。这一结果表明重组靶定AFP腺病毒rAdv-AFPsiRNA可有效特异地抑制人卵巢癌细胞的增殖,为卵巢癌的治疗提供了一种新的基因治疗方式。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R737.31

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