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《天津医科大学》 2002年
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新生鼠缺氧缺血性脑损伤神经元型一氧化氮合酶基因表达的研究

程佶  
【摘要】:目的 围生期窒息致缺氧缺血性脑损伤(HIBD),常危及新生儿生命并留有 严重神经系统后遗症,已成为新生儿期危害最大的常见病。缺氧缺血性脑损 伤是一个逐步进展的过程,从开始的原发损伤阶段向继发损伤(再灌注损伤) 阶段发展。近年研究表明,NO在新生儿HIBD发病机制中起重要作用。NO 是由NO合酶(NOS)以L-精氨酸为底物合成。NOS有三种亚型:神经元 型 NOS(nNOS)、内皮细胞型 NOS(eNOS)及诱导型 NOS(iNOS)。在脑 缺氧缺血,nNOS 介导了早期神经元损伤。我们对所建立的新生鼠缺氧缺血 性脑损伤模型进行 nNOS mRNA的表达研究,探讨 HIBD时 nNOS变化规律 和作用。 方法1.新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型的建立 新生7日龄Wistar大鼠行颈正中切口,左颈总动脉与静脉、神经分离后 结扎。术后恢复2小时,后置于 2500ml密闭玻璃容器中。该容器置于 37℃ 水浴中,以 1.5-2.5L/min的速度输入 8%氧气(O_2)和 92%氮气(N_2)的混 合气体2个时。 2.实验分组 56只新生大鼠随机分为HIBD组或对照组。对照组只分离左颈总动脉不 结扎,也不予低氧环境。HIBD组分别于缺氧开始后0小时、1小时(缺氧中)、 2小时(缺氧结束)及6小时处死;对照组于相对应的时间点处死。两组每 个时间点7只动物,其中5只用于nNOSmRNA表达的研究,2只用于组织 学检查。 3.组织学检查 动物经左心室灌注冷生理盐水,后灌注 4℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲固定 液(0.1M pH 7.4)固定。取出左侧大脑半球(颈总动脉结扎侧),冠切留取 海马丘脑水平脑组织(厚约5mm),在上述固定液中固定5天。石蜡包埋后制 作 4 u m切片,HE染色,光镜观察。 4.NA提取 动物断头处死,迅速取出左侧大脑半球(颈动脉结扎侧)并分离出皮层 和海马小块脑组织。标本迅速置于液氮中,于一 80 OC冻存备用。使用 TRIZ。l 试剂,按照说明步骤提取总RNA。 5.RT——PCR ①逆转录(RT)反应总体积为20…。反应条件:25”C,10min—42”C、50min —70 C.15ffiifl-4“C,lffilfl。 ②PCR总反应体系为25p。反应条件:94OC3 min,跟随5次循环(9 ”C40sec—63C40sec—72℃30 see),继续23次循环门”C40sec一引C40sec -72”C 30 see),72℃7 min。PCR产物经10琼脂糖凝胶电泳,滇乙锭(EB) 染色后拍片。 结果1.组织学检查 ①对照组:各时点脑组织均无明显神经元损伤表现,细胞形态正常。皮 质 I——VI层神经元胞体完整,胞核清晰。海马各亚区,CA、CAZ、CA3。 CA4及齿状回区域,均无神经元损伤及细胞丢失。 ②缺氧后 oh及 lh组:与对照组比较,无明显组织学改变。 ③缺氧后Zh组:皮层和海马可见散在变性神经元,表现为胞体稍缩小, 胞浆呈嗜酸性染色增强,胞核稍深染。 ④缺氧后6h组:皮层和海马可见明显变性坏死神经元和水肿,呈层状或 灶状分布。表现为胞体皱缩,胞浆呈均匀的嗜酸性染色,胞核固缩,细胞周围 间隙增大。 2·nNOSmRNA的表达情况 ①对照组:uN OSmRNA在对照组各时点均有表达,但各时点之间差异 无显著性(P-0月*9,P>0刀5)。 3 硕士研究生学位论文 ②mBD组:各时点uN OSmRNA表达出现明显变化(卜9.2556,P<0刀引。 H儿和 H6h nNOSmRNA水平明显高于 H加和 H1h,H6h表达高于 HZh(q=3.7446, P<0*5),而H*和Hlh Z间表达无明显差异(q=0*293,P>0*5)。 ③两组比较:H。h和Hlh与对照组比较nNOSmRNA表达无明显差异 (P>0刀5),而 HZh和 H6h nNOShRNA水平明显高于对照组(P<0刀引。 ④结果显示:nNOSInRNA在对照组即有表达。但在HIBD组,缺氧2 小时后nNOSmRNA表达开始增加,6小时增加明显,均高于对照组。 结论1.我们对新生7日龄皿s*一大鼠结扎一侧颈总动脉后予低氧<8%0。)二 小时造成缺氧缺血性脑损伤。组织病理学检查显示结扎侧脑皮层和海马可见 神经元变性坏死和水肿,与文献描述一致。证实新生鼠缺氧缺血性脑损伤模 型建立成功。 2.正常情况下,nNOS 在脑皮层、海马等组织有表达,调节正常神经生 理功能。但在脑缺氧缺血早期,nNOSInKNA表达明显增加,介导了早期神 经元损伤。 3.本实验从分子水平探讨* 的发病机制,为进一步
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R722.121

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