收藏本站
《天津医科大学》 2002年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

血管抑素基因克隆及在E.coli DH5α的表达

王瑞珉  
【摘要】: 血管抑素(Angiostatin,AS)是血浆纤溶酶原(Plasminogen,PLG)经蛋白水解酶降解生成的多肽片段,是直接作用于血管内皮细胞的血管生成抑制剂。AS可以阻抑血管生成治疗由病理性血管形成而导致的疾病,尤其是可通过抗肿瘤新生血管生成抑制肿瘤的生长与转移,有重要的临床应用价值。本研究以高效、低毒、广谱且无耐药性产生的内源性血管抑制因子AS为研究对象,构建含AS基因的分泌型重组表达质粒pEZZ18-AS,在E.coli DH5α内表达并对其进行鉴定。 本研究第一部分包括肝组织中总RNA的分离提取;RT-PCR扩增出血管抑素基因。首先,采集术后新鲜肝组织,并于无RNase的条件下分离纯化总RNA。其次,在其完整性及纯度鉴定后做RT-PCR扩增目的基因AS,分别在上下游引物引入限制性内切酶EcoR I与Xba I的酶切位点及相对应的保护碱基。本部分成功获取AS(即Kringle 1-4区域)与PLG Kringle 1-5区(即K1-5)的基因片段。将K1-5 PCR产物测序,结果为:除测序引物后边有一段不稳定序列,其余序列均与Gene Bank里PLG cDNA中相应核酸序列完全相同,无碱基错配、插入或遗漏的出现。 第二部分是AS基因分泌型表达载体的构建。用限制性内切酶EcoR I与Xba I对目的基因AS、表达载体pEZZ18行双酶切,酶切产物纯化后利用大肠杆菌T_4DNA连接酶连接构成重组子pEZZ18-AS,并转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素LB平板初筛后,以菌液PCR和重组子的单、双酶切行进一步鉴定。随后取通过上述鉴定的重组克隆菌,对重组子插入片段测序,结果为:AS基因开放读码框与表达载体的读码框正确匹配相连,但在其Kringle 4区相当于编码PLG的Lys~(414)密码子AAA的第一位碱基由A突变为G,导致相应的氨基酸残基突变为Glu。 天津医科大学硕士学位论文 本研究第三部分为重组表达质粒在 E colt DH5a中的初步表达与鉴定。将 含重组质粒pEZZ18叭S与空质粒pEZZ18的 Ecoli DH5a同时于 AInp”LB液体 中培养,当振摇培养的菌液OD。值约为0.5时,于诱导对照管中加入IPTG至 终浓度为Inunoffe:继续培养二小时,将离心收集的诱导及未诱导的细菌沉淀 进行SDS-PAGE。与空质粒菌比较,重组菌在略小于66kD的标准蛋白处出现 一条特异条带,与融合蛋白ZZ-AS分子量理论值6IkD相符。而在重组菌与含 空质粒菌经超声碎细胞并离心后,取上清进行ELISA检测,两组所测OD0。值 比较,P<0刀 1,差异有统计学意义,说明重组菌里有重组 AS表达。 本研究成功构建了含AS基因的分泌型表达质粒pEZZ18-AS,并在ECOli DH5a中进行了表达,经SDS-PAGE及ELISA法鉴定重组培养菌内有AS的表 达。为以后获得足量AS进行抗肿瘤血管生成的体内外研究奠定了基础。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q785

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 董晓弟;刘兆普;刘海燕;焦绪栋;秦松;;重组别藻蓝蛋白β亚基(His-β~(APC))表达菌株遗传稳定性的研究[J];生物学杂志;2011年04期
2 张晓嫒;叶长芸;徐建国;;肠出血性大肠埃希菌O157:H7质粒pO157上毒力因子的研究进展[J];疾病监测;2011年06期
3 陈国武;孟纯阳;蒋电明;胡侦明;;重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF_(165)转染兔成骨细胞条件的优化[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年20期
4 徐燕;周彦;;多药耐药肺炎克雷伯菌9种可移动遗传元件标记研究[J];中华医院感染学杂志;2011年15期
5 劳文艳;商迎辉;焦正;劳凤学;;聚乙二醇修饰多壁碳纳米管对质粒DNA的影响[J];上海大学学报(自然科学版);2011年03期
6 于长燕;郑秀;朱燕;孟庆艳;王梦晓;高强;;肉葡萄球菌tat-gfp融合基因的构建与表达[J];生物技术通报;2011年08期
7 季思思;朱义广;彭东海;阮丽芳;孙明;;苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆[J];华中农业大学学报;2011年05期
8 张薇;沈权;彭正羽;;NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究[J];浙江大学学报(医学版);2011年04期
9 陈豪;李丹;林纳;黄月红;陈志新;王小众;;乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定[J];福建医科大学学报;2011年03期
10 石艳春;韩堃;毛颖佳;郑源强;;共表达羊布氏菌P39基因与增强型绿色荧光蛋白基因逆转录病毒质粒的构建[J];中国生物制品学杂志;2011年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周利刚;向华;;极端嗜盐古菌隐蔽型质粒pZMX101的研究[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
2 马苏;姜平;段舒怡;李玉峰;;猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体研制[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年
3 吴丛梅;殷玉和;韩依辰;;药用级含IL-24基因质粒提取工艺的研究[A];吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C];2008年
4 吴淑燕;宋国蓉;眭阳;李嫄渊;吕杰;李琼;黄瑞;;伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)与巨噬细胞自噬和凋亡关系的研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
5 朱建国;周杨;段新平;张明军;李莉;王铁东;逄大欣;欧阳红生;;绿色荧光蛋白基因体外转录质粒的构建[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
6 陆正齐;朱灿胜;刘然义;谢发君;胡学强;;质粒pAAV-MCS转导的骨髓间充质细胞导向的CNTF基因靶向性治疗慢性进展型多发性硬化[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年
7 胡晓敏;袁永明;袁志明;;苏云金杆菌杀虫质粒在敏感昆虫体内体外的结合转移研究[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年
8 程时丹;王晓瑾;乔敏敏;周季兰;吴云林;;Smad4基因抑制人类胃癌细胞株生长作用的实验研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
9 耿春银;李德莉;刘佳佳;陈大雷;杨连玉;;猪Ghrelin基因质粒对小鼠的促生长效应研究[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
10 尹志康;吴小候;罗春丽;何云锋;刘川;杜虎;;TGF-β1基因特异性shRNA真核表达载体的构建及其基因抑制作用[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 刘霞;美利用质粒制造诱导多功能干细胞[N];科技日报;2009年
2 农业部饲料工业中心 陆文清博士;使用饲用抗生素危害到底有多大[N];中国畜牧兽医报;2005年
3 Wang Johson译;非病毒游离质粒基因载体技术获美国专利[N];中国高新技术产业导报;2002年
4 直尺编译;健康新武器——D N A疫苗[N];科技日报;2002年
5 卢苏燕;研究显示鼠疫杆菌有向抗多药性发展的危险[N];医药经济报;2007年
6 吴一福;PTFE血管材料可携载VEGF基因转染[N];中国医药报;2006年
7 付毅飞;建造极端微生物“细胞工厂”[N];科技日报;2004年
8 ;放线共生放线杆菌黏附性研究[N];科技日报;2006年
9 徐峰;肿瘤与血管生成息息相关[N];医药经济报;2001年
10 陆志城;安普霉素让抗生素寿命延续[N];医药经济报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陶开山;血管抑素抗肿瘤血管生成机制的实验研究[D];第四军医大学;2004年
2 梁小燕;抑癌基因LKB1调控细胞周期分子机制研究[D];重庆医科大学;2010年
3 包大士;重组腺病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究[D];苏州大学;2001年
4 徐元喜;Cytophaga hutchinsonii遗传操作体系的建立及应用[D];山东大学;2012年
5 徐娟;肠道病毒EV71 VP1基因的优化和免疫原性的研究[D];南京医科大学;2011年
6 郑凯;Angiostatin对膀胱肿瘤新生血管抑制作用的实验研究[D];第四军医大学;2004年
7 杨波;阻断TGF-β信号通路增强NK-92细胞过继性治疗的抗肿瘤效应[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
8 刘海俊;角膜缘移植联合丝裂霉素和血管抑素治疗严重眼表碱烧伤的作用机制研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
9 王荫榆;有关乳酸菌质粒和表达体系的研究[D];复旦大学;2003年
10 马永平;含质粒人两歧双歧杆菌的分离、质粒测序和生物信息学分析[D];重庆医科大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王瑞珉;血管抑素基因克隆及在E.coli DH5α的表达[D];天津医科大学;2002年
2 董流昕;转基因抗草甘膦大豆参比分子的构建[D];北京林业大学;2005年
3 曹鹏;人脑胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)原核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定[D];第二军医大学;2009年
4 胡伶俐;牛杀菌—通透性增加蛋白和防御素基因融合质粒的构建及其在大肠杆菌中表达[D];华中农业大学;2010年
5 佘其美;TNF-α、胰岛素和地塞米松对稳定表达人脂联素3T3-L1细胞PPAR-γ2mRNA表达的影响[D];安徽医科大学;2005年
6 牛牛;COX-2基因和肺癌相关性研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2006年
7 田海山;酸性成纤维细胞生长因子发酵工艺的优化[D];吉林大学;2007年
8 蔡燕飞;P-糖蛋白mRNA中IRES序列分析及与肿瘤多药耐药性关系研究[D];江南大学;2011年
9 高卓;侧脑室注射质粒pLXSN介导Bcl-2基因对大鼠脑梗塞及BDNF影响的研究[D];中国医科大学;2004年
10 黄强;犬经皮插管肾动脉注射人HGF基因的实验研究[D];南京医科大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026