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《天津医科大学》 2003年
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含CDglyES的双功能融合基因的重组腺病毒对放疗增敏作用的实验研究

孙健  
【摘要】: 本研究首先用PCR法从课题组构建的含CD基因的重组腺病毒(rAd-CD)中扩增出CD基因,将其插入腺病毒穿梭质粒(pAdTrackCMV),而后从含ES基因的分泌型表达质粒pEZZ-18-ES中扩增出glyES基因,将两者融合构建成含CDglyES融合基因的腺病毒穿梭质粒phdTrackCMV-CD。然后转化大肠杆菌BJ5183,构建出重组腺病毒质粒pAdTrackCMV-CDglyES,用卡那霉素筛选重组质粒,用限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序对插入基因进行鉴定。然后经脂质体介导转染293细胞进行包装和扩增,借助报告基因监控和筛选重组腺病毒。采用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用TCID_(50)法滴定其浓度。为了证实融合基因CDglyES具有双重活性,进行了初步的体外抑瘤试验。将纯化重组腺病毒稀释成1×10~(10)TCID_(50)/L,分别感染肝癌细胞株SMMC-7721和宫颈癌细胞株Hela 24小时,给予前药5-FC,继续培养48小时后,检测肿瘤细胞生长抑制率;并与对照重组病毒rAd-CD和rAd-LacZ的肿瘤细胞生长抑制率进行比较。结果显示融合基因系统对SMMC-7721细胞的抑制率达78.2%,与rAd-LacZ/5-FC(52.2%)系统比较有显著性差异,P<0.01;融合基因系统(78.1%)和rAd-CD/5-FC系统(77.7%)对Hela细胞的生长抑制率与rAd-LacZ/5-FC系统(50.2%)比较有显著性差异,p<0.01;而rAd-CDglyES/5-FC系统和rAd-CD/5-FC系统比较无显著性差异,p>0.5。这一结果证实了CDglyES融合基因中,基因的融合未影响 硕士研究生学位论文 CD基因活性。浓缩的rAd一cDglyES细胞培养上清液对脐静脉血管内皮细胞 ECV一304增殖的抑制率为78.7%,同样浓缩的rAd一CD细胞培养上清液抑制率仅 为24.2%,有显著性差异,P0.01,同样证实了CDglyES融合基因中基因的融 合未影响ES基因的活性。 在体内水平的试验中,对津白11号小鼠的MA737乳腺癌模型进行了抑瘤试 验。将MA737移植瘤小鼠分为7组,分别是空白对照组、单放组、单予CDgl妞S 组、CDglyES+放疗(14Gy)组、CDgl正S+5一FC组、CDglyES+5一FC+放疗(14Gy) 组、CDglyES+5一FC十放疗(7Gy)组。CDglyES用法为排肠肌注射,5一FC用法为腹 腔注射。设定了多个观察指标对各组结果进行比较:(I)肿瘤大小:试验结束时 各组分别处死一只瘤体大小居中的小鼠并作解剖,各组平均瘤体大小排列顺序 (由大到小)为第1组、第3组、第7组、第5组、第2组、第4组和第6组; (2)平均瘤体重量:第1组的肿瘤最重,生长最为迅速,按分组要求处理后各组 肿瘤均表现出不同程度的生长延迟,第6组的生长延迟最为明显,远高于其余 各组,肿瘤平均重量也远小于其他各组;(3)中位生存期:第1组的平均中位生 存期最短,第6组的平均中位生存期明显长于其余各组,P0.01,其余各组平 均中位生存期排序为(由短到长)第3组、第2组、第5组、第4组、第7组; (4)病理组织形态:按分组要求处理25天后,第l组的肿瘤内仍可找到较多的核 分裂象,肿瘤生长仍然旺盛,第6组的肿瘤内可见较多的凋亡现象,肿瘤血管 分布也明显少于其余各组;⑤肺转移情况:按分组要求处理25天后,第1组的 肺组织内有肿瘤转移灶且体积较大,将正常肺组织挤压变形、肺泡壁塌陷,而 第4组肺内转移灶明显小于第1组,转移性肿瘤细胞出现比较多的坏死、组织 碎片较多,第6组小鼠肺内转移灶几乎难以发现,肺泡壁基本维持正常形态。 3 硕士研究生学位论文 重组腺病毒(rAd一CDglyES)联合放疗组小鼠的放疗相关毒性反应与对照组相 比并无显著增加。以上结果证实:首先,含双功能融合基因的重组腺病毒 (「Ad一CDglyES)具有CD基因活性,对肿瘤细胞具有直接杀伤作用,亦具有 ES基因活性,对肿瘤细胞具有间接的抑制、杀伤作用;其次,该重组腺病毒表 达产物具有ES活性,能抑制肿瘤新生血管的形成,进而阻止肿瘤细胞发生远 处转移;第三,本研究首次揭示该重组腺病毒具有CD及ES双重对放疗的增 敏作用,其中CD基因将5一FC转化为5一FU,发挥放疗增敏作用,ES基因表达 产生内皮抑素,也起到了放疗增敏作用,其机制可能是将肿瘤血管的内皮细胞 转变成为射线细胞毒性作用的靶细胞,导致其有丝分裂后死亡或凋亡。 本研究应用重组腺病毒载体介导CDglyES融合基因进行了初步的体外和体 内抑瘤试验,结果证明重组腺病毒rAd一cDglyEs在体外、体内水平均具有直接 和间接抑瘤作用,并具有明显的放疗增敏作用,证明本研究的构思正确取得了 预期的结果。同时还有许多问题,如基因治疗中前体药物给予的最佳时间和剂 量,联合放疗的最佳时间及剂量,何种、何形式的基因对放疗增敏作用强弱的 比较,以及基因治疗+放疗对不同肿瘤的作用差异的观察等,这些问题仍需进 一步深入研究,以期找到更为有效的治疗恶性肿瘤的方法。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R73-36

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