甲状旁腺素相关蛋白1-141和1-86的表达与生物活性测定

【摘要】：甲状旁腺素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)最初作为一种引起恶性肿瘤患者发生高钙血症的蛋白被发现。随着对其研究的深入,证实其在大多数组织器官都有所表达,提示其在正常细胞生长分化中的重要性。PTHrP主要通过自分泌、旁分泌和胞内分泌的作用方式发挥作用。PTHrP被蛋白酶作用后,产生一组具有不同生物活性的多肽,它的作用靶组织与靶器官涉及非常广泛。PTHrP的这些生理功能,预示着PTHrP未来在临床上广泛的应用前景。 本实验采用TKM法自人血细胞中提取基因组DNA,并以之为模板PCR扩增hPTHrP1-141编码基因。将该基因克隆入pGEM-T easy载体,并进行DNA序列分析。在此基础上,将编码hPTHrP1-141和hPTHrP1-86的基因片段分别克隆到表达载体pQE-30Xa上,并转化入E. coli M15[pREP4],进行融合表达。表达条件经优化后,rhPTHrP1-141和rhPTHrP1-86的表达量分别达到60mg/L培养基和4mg/L培养基。重组蛋白rhPTHrP1-141和rhPTHrP1-86分别占菌体可溶性蛋白的34.64%和6.38%。目的蛋白含6×His纯化标签,可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,梯度增加冲洗液中咪唑浓度以除去非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,超滤离心法浓缩。体外培养大鼠骨肉瘤细胞系UMR 106,以rhPTH1-34标准品作为阳性对照,将PTHrP1-141和PTHrP1-86加入细胞培养液,使其终浓度分别为10~(10)mol/L、10~(-9)mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L和10~(-5)mol/L。PTHrP能与存在于UMR 106细胞膜上的与G蛋白相偶连的PTH1型受体(PTH1R)结合,激活