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《天津医科大学》 2005年
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GSTP1基因新突变体AY887902的分子克隆和功能研究

赵振理  
【摘要】:畅继武教授利用分子生物学技术对膀胱移行上皮癌研究后,提出了膀胱移行上皮癌可分为Ⅰ类癌和Ⅱ类癌两类,为了进一步深入研究Ⅱ类癌在基因水平的发生机理,先期已经进行了Ⅱ类癌与正常膀胱黏膜抑制消减杂交文库的构建,并发现了五个相关致病基因的ESTs,BQ135230是其中之一。为了进一步探讨BQ135230的作用机理和应用前景,我们做了如下实验工作: 实验目的:1:BQ135230全长扩增并应用生物信息学推测其ORF、染色体定位和功能,同时制备AAX14401抗体:anti-AY,为后续工作做准备。2:检测AY887902的功能。3:探讨AAX14401在膀胱肿瘤中的表达及其意义。 实验方法:1:从新鲜的膀胱肿瘤组织中提取RNA,并用RACE方法获得BQ135230的5’端和3’端的DNA序列,然后应用GeneTool软件合成RACE测序结果。2:根据NCBI提供的ORF Finder程序、e-PCR程序、Blastn、Blastp,同时应用ExPASY ProtParam Tool、JUF0软件并结合Primer软件对AY887902全长及其相应蛋白AAX14401进行分析。Sequin软件编辑前述结果,上报NCBIGENBANK,获取GenBank accession number。3:根据计算机分析ORF翻译氨基酸寡肽与GSTP1在40-52位上差异较大,以此进行多肽合成,并免疫小鼠获取多克隆抗体anti-AY。4:用含有BamHI酶切位点和起始密码子的上游引物和含有ApaI酶切位点和终止密码子的下游引物,以含有AY887902的RNA为模板进行PCR反应,PCR产物电泳后在150bp左右可见一条带。然后将PCR产物纯化,利用BamHI、ApaI进行双酶切反应,将酶切产物进行电泳,切胶回收150bp左右的DNA片段,即为具有粘性末端的ORF cDNA。将PCDNA3质粒同样利用BamHI、ApaI进行双酶切反应后电泳,在约6000bp左右处出现一条带,切胶回收即为具有粘性末端的PCDNA3质粒片段。上述两个片段连接形成PCDNA-AY质粒。转入感受态大肠杆菌,LB固体培养基选择氨苄抗性菌落,
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R737.14

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【参考文献】
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