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大鼠甲状腺激素受体β1 cDNA克隆及其在E.coli.中的表达

穆成  
【摘要】:甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor,TR)属于核受体超家族的成员,广泛分布在各种组织中。TR存在2种主要的亚型:TRa和TRβ。而由于转录起始点以及剪切方式的不同,每种亚型又包括若干同功体(isoforms)。主要的有TRa1、TRa2、TRa3、TRΔa1、TRΔa2、TRβ1、TRβ2、TRβ3、TRΔβ3等。在临床上,TRβ基因与TH抵抗(resistance to thyroid hormone,RTH)有着紧密联系。而进一步了解TRβ结构,对于设计新型降脂药物也有重要意义。 本研究工作中,我们以大鼠肝脏组织的总RNA为模板,RT-PCR方法扩增出全长大鼠甲状腺激素受体β1(rTRβ1)基因编码序列,克隆入pGEM-T Easy载体,纠正其错配碱基后将目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa,测序鉴定。重组表达质粒pQE-30Xa/rTRβ1转化入E.coli M15[pREP4],进行融合表达。SDS-PAGE电泳查看表达产物大小和表达量,Western-blotting进一步鉴定。表达条件经优化后,rTRβ1的表达量达到6mg/L培养基。重组蛋白rTRβ1占菌体蛋白的24.32%。目的蛋白含6×His纯化标签,可以经金属螯合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,冲洗除去非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,透析冻干浓缩。经电泳迁移率改变试验(EMSA)和放射性配体结合试验(RLBA)证实,重组rTRβ1可与目的DNA和T_3特异性结合。


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