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《天津医科大学》 2007年
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中药预防大鼠小肠移植慢性排斥反应的实验研究

靳小石  
【摘要】: 第一部分大鼠小肠移植模型的建立和鉴定 目的建立大鼠小肠移植模型并研究排斥反应机理。方法利用显微外科技术构建同系和异系大鼠小肠移植模型,分为3组:同系移植组、异系移植组、异系移植使用CsA组(环孢素组)。分别在术后7天、14天、28天、60天进行移植物活检,常规病理学检测,应用Realtime-PCR技术检测移植物内IL-4、INF-γ分子mRNA转录水平以观察急性排斥反应,采用免疫组织化学方法检测CD68以观察单核巨噬细胞浸润情况,使用Realtime-PCR技术和Western blot技术检测移植物内TGFβ1、PDGF mRNA转录水平及蛋白表达水平,并应用免疫组化方法对上述两种蛋白的表达进行定位,以明确其与排斥反应的关系。结果(1)异系移植组全部受体大鼠均在术后11天内死亡。(2)环孢素组IL-4、INF-γmRNA分子转录水平在术后第7天较同期的同系移植组有显著升高,第14天、28天、60天标本的检测结果较同期的同系移植组无显著差异。(3)坏孢素组在术后第60天的慢性排斥反应评分显著高于同期的同系移植组。(4)CD68检测提示在术后第60天环孢素组较同期的同系移植组显著升高。(5)坏孢素组的TGF-β1及PDGFmRNA转录水平和蛋白表达水平在第60天也较同期的同系移植组显著升高,免疫组化可见TGF-β1及PDGF在间质内高表达,表明环孢素组术后第60天开始出现慢性排斥反应,并同时伴有TGF-β1及PDGF分子的表达水平升高。结论(1)移植术后的早期存在急性排斥反应。(2)术后第60天环孢素组的单核巨噬细胞浸涧严重。(3)异系大鼠小肠移植经环孢素治疗组术后60天即可出现慢性排斥反应表现,并同时伴有CD68、TGFβ1、PDGF因子的显著高表达,提示CD68、TGFβ1、PDGF列于判定慢性排斥反应具有指导意义。 第二部分单味中药对慢性排斥反应的预防作用 目的观察单味中药对于慢性排斥反应的预防作用并筛选有效药物。方法利用显微外科技术构建异系小肠移植模型,受体大鼠应用环孢素1个月后按照实验要求随机分组,分别给予雷公藤、粉防己碱、青藤碱,同时设立同系对照组及异系对照组。术后7天、14天、28天、60天、90天行移植物活检,常规病理学检测,应用免疫组织化学方法检测CD68以观察单核巨噬细胞浸润情况,使用Realtime-PCR技术及Western blot技术和免疫组织化学方法检测TGFβ1、PDGF mRNA转录水平和蛋白表达水平,于实验终点应用流式细胞技术检测移植物和外周血T细胞亚群以观察受体和移植物的免疫功能。结果(1)慢性排斥反应病理评分在第90天各组间比较中出现显著差异,其中粉防己碱组、青藤碱组和异系对照组评分显著高于同期雷公藤组和同系对照组。(2)CD68的检测结果在术后第90天组间比较中有显著差异,粉防已碱组、青滕碱组、异系对照组中表达显著高于雷公藤组和同系对照组。(3)TGFβ1和PDGF mRNA转录水平在术后第60天和第90天的组间比较中有显著差异,粉防己碱组、青藤碱组、异系对照组的转录水平显著高于雷公藤组和同系对照组,TGFβ1和PDGF蛋白定量及免疫组化结果与mRNA转录水平一致。(4)实验终止时,外周血T细胞亚群检测表明雷公藤组和粉防己碱组CD4+/CD8+显著降低,移植物T细胞亚群检测表明异系对照组CD4+/CD8+显著低于其他各组。(5)肝肾功能检测表明粉防己碱组和青藤碱组AST值显著升高。结论(1)粉防己碱组、青藤碱组和异系对照组的组织破坏程度和单核巨噬细胞浸润程度重于雷公藤组和同系对照组。(2)术后第60天和第90天,粉防己碱组、青藤碱组、异系对照组的TGFβ1和PDGF因子较同时点各组处于较高水平。(3)雷公藤和粉防己碱对于免疫功能有一定的抑制作用。(4)异系列照组移植物CD8+淋巴细胞浸润增多。(5)粉防己碱和青藤碱对于肝功能有一定影响。(6)雷公藤组与其它中药治疗组相比可更为有效地减低TGFβ1、PDGF因子的表达,减轻和延缓慢性排斥反应的发生和发展。 第三部分复方中药对慢性排斥反应的预防作用 目的观察复方中药对慢性排斥反应的预防作用并进行筛选有效复方中药。方法利用显微外科技术构建异系小肠移植模型,应用环孢素1个月后,按照实验要求随机分组,在予以雷公藤的基础上分别给予黄芪、丹参、黄芪-丹参,同时设立同系对照组及异系对照组。分别于术后术后7天、14天、28天、60、90天行移植物活检,常规病理学检测,应用免疫组织化学方法检测CD68以观察单核巨噬细胞浸润情况,使用Realtime-PCR技术和Western blot技术及免疫组织化学方法检测TGFβ1、PDGF mRNA转录水平及蛋白表达水平,以明确各移植组TGFβ1、PDGF水平的变化,应用流式细胞技术检测实验终止时移植物和外周血T细胞亚群以观察受体和移植物的免疫功能。结果(1)慢性排斥反应病理评分在第90天各组间比较中出现显著差异,其中丹参组、黄芪-丹参组、异系对照组的病理评分显著高于同期黄芪组和同系对照组。(2)CD68的检测结果显示术后第90天组间比较中有显著差异,其中异系对照组CD68表达显著高于同期各实验组和同系对照组。(3)TGFpl和PDGF mRNA转录水平、蛋白表达水平检测结果显示在第60天和第90天组间比较有显著差异。在第60天组间比较,异系对照组的转录水平显著高于同期各组,第90天组间比较表明异系对照组、丹参组、黄芪-丹参组的转录水平显著高于同期的黄芪组和同系对照组。(4)实验终止时移植物T细胞亚群检测表明,异系对照组移植物中CD4+/CD8+显著减低,外周血T细胞亚群检测中各组之间无显著差异。结论(1)丹参组、黄芪-丹参组、异系对照组的组织损伤程度要重于黄芪组和同系对照组。(2)异系对照组单核巨噬细胞浸润严重。(3)在第60天和第90天异系对照组、丹参组、黄芪-丹参组的TGFβ1和PDGF因子处于较高水平。(4)异系对照组移植物中CD8+淋巴细胞浸润增多。(5)雷公藤-黄芪配伍与其它配伍组相比可更为有效地抑制TGFβ1、PDGF的表达,减轻移植后期移植物中单核巨噬细胞的浸润,显著延缓小肠移植术后排斥反应的进程。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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