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《天津医科大学》 2007年
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用于研究CXCR4和Survivin启动子活性的重组腺病毒构建及其在乳腺癌细胞系的转录靶向性评价

李晓霞  
【摘要】: 乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万妇女患乳腺癌,50万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家,乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位,近20年来在我国的发病率逐渐升高,已严重威胁女性健康,仅次于宫颈癌。目前乳腺癌的治疗方法主要有:外科手术切除、放疗、化学治疗及免疫治疗,但对复发及远处转移的乳腺癌治疗效果不佳。近年来基因治疗日益显示其良好的应用前景,有些基因已处于临床试验阶段如抑癌基因p53、自杀基因(CD)和多重耐药基因(MDR)等。由于肿瘤是一类多基因参与的分子疾病,是在各种环境因素的作用下,人体正常细胞内的前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段演化而形成的,因此从基因水平调控细胞的基因表达过程理应成为治疗肿瘤的理想手段。但是目前基因治疗的效果并未达到我们的最大预期,其中载体对于外源基因的转导效率及在肿瘤细胞的靶向性是限制其治疗效果的重要因素。因此,关于载体的研究依然是肿瘤基因治疗研究领域的攻关方向之一。 腺病毒是目前在肿瘤基因治疗中应用相当广泛的载体之一,增强其对外源基因的转导和转录靶向性,可以大大提高治疗效果。前者可通过改变腺病毒的嗜性增强腺病毒载体的转导靶向性,即增加腺病毒载体对靶细胞的感染率,后者可利用肿瘤特异性启动子(tumor specific promoter,TSP)在转录水平对外源基因的调控实现其在肿瘤细胞中的特异表达。就后者而言,启动子活性在不同肿瘤或组织中的特异性以及对外源基因的调控活力参差不齐,应进行慎重的选择和评估。而理想的启动子除了能够在肿瘤细胞特异高效启动外源基因的表达之外,还应在肝脏等重要器官保持较低的活性,从而提高腺病毒载体使用的安全性,我们将这类启动子的特点归结为“tumor on/liver off”。因此,从某种程度上说,启动子的转录靶向性评价在肿瘤的基因治疗中不仅具有重要价值,而且也是决定其能否最终走向临床试验的必要研究。 趋化因子受体CXCR4和凋亡抑制蛋白Survivin是近年来肿瘤研究领域中的热点,已被证实在乳腺癌细胞中高度特异性表达,这提示CXCR4和Survivin启动子极有可能成为乳腺癌基因治疗中TSP的候选者,具有潜在的临床价值。趋化因子受体CXCR4是一个具有352个氨基酸且高度保守的与G蛋白偶联的七次跨膜受体,目前已报道至少23种不同的恶性肿瘤细胞表达CXCR4。Muller等报道乳腺癌细胞系和乳腺癌组织均高度表达CXCR4,同时证实CXCR4与其配体CXCL12(SDF-1)共同作用的生物轴在肿瘤转移过程中发挥重要作用。而Survivin是近年发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成员,由142个氨基酸组成,是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子,组织分布特征具有明显的细胞选择性,仅在胚胎细胞和多种肿瘤细胞中表达特别是乳腺癌、胰腺癌、食管癌、原发性恶性胶质瘤及卵巢癌,而在成人正常组织中不表达。目前,已有研究证实CXCR4启动子在肾癌和黑色素瘤中呈现肿瘤特异性,而Survivin也作为TSP在神经胶质瘤、肝癌和胃癌中表现了良好的应用前景。因此,本文的研究重点即评价并比较重组腺病毒系统中CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞系的转录靶向性,具有重要的实际意义和临床价值。 首先,我们通过荧光定量PCR法检测不同生物学性状的乳腺细胞系中CXCR4和Survivin的mRNA水平的表达,结果表明,相对于乳腺上皮HBL100细胞,CXCR4和Survivin基因在乳腺癌细胞系均为高度表达(P<0.05)。对于CXCR4基因,各细胞之间CXCR4 mRNA的表达水平依次为:MDA-MB-231>MCF7>T-47D MDA-MB-435>HBL100,其中高转移性细胞系MDA-MB-231的表达水平较其它细胞显著升高(P<0.05),而MCF7和T-47D(均为低转移细胞系)之间无显著性差异(P>0.05)。Survivin在各细胞的mRNA表达水平依次为:T-47D>MDA-MB-435>MCF7>MDA-MB-231>HBL100,在乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-435之间无明显差异(P>0.05)。其中腺癌MCF7和导管癌MDA-MB-435之间无明显差异(P>0.05),但导管癌T-47D和MDA-MB-435之间,腺癌MCF7和MDA-MB-231之间却有明显差异(P<0.05)。因此得出结论,CXCR4与乳腺癌的转移密切相关,而Survivin是一个独立于乳腺癌病理类型的指标,二者在乳腺癌细胞系的高度表达,提示二者作为肿瘤治疗靶点的可能性。 继而,采用套式PCR方法扩增CXCR4和Survivin启动子,将其分别克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体pEGFP-1和含有荧光素酶(Luciferase)的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染乳腺癌细胞系和HBL-100,荧光显微镜下观察EGFP的表达情况并测定两个启动子在乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。结果显示,长度分别为279bp和262bp的CXCR4和Survivin启动子在3种乳腺癌细胞中均表现了特异的转录活性。CXCR4启动子在MDA-MB-231中的活性高于其它两种乳腺癌细胞(为pGL3-Control的35.21%);而Survivin启动子在MCF7细胞中的活性高于其它两种乳腺癌细胞(为pGL3-Control的32.72%)。对于同一种乳腺癌细胞,CXCR4启动子在MDA-MB-231中的活性高于Survivin(P<0.05);而在MCF7细胞中Survivin启动子的活性更高(P<0.05),二者在T-47D细胞中的启动子活性相当(P>0.05)。但是转染效率仍然受到很多因素的影响,如DNA,脂质体剂量,转染的细胞数量、暴露时间以及不同细胞对脂质体的耐受程度等,因此对于CXCR4启动子在基因治疗靶向性的评估仍然需要在重组腺病毒系统中进行。 为了系统地考察腺病毒系统中CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞的特异转录靶向性,首先在细菌内同源重组方法的基础上采用改进的两步法高效构建重组腺病毒质粒pAdGL3BCXCR4、pAdGL3BSurvivin和pAdGL3BCMV,PacI酶线性化后经脂质体转染AD293细胞,包装为完整的腺病毒颗粒reAdGL3BCXCR4、reAdGL3BSurvivin和reAdGL3BCMV。经过扩增、纯化和鉴定后用于乳腺癌的转录靶向性的评价研究。我们分别用三个不同的剂量(1×10~7、2.5×10~7和5×10~7TCID_(50))感染多个乳腺癌细胞系,检测reAdGL3BCXCR4和reAdGL3BSurvivin的启动子活性,结果证实CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞中表现了特异的转录活性,具有特异高效表达外源基因的作用,呈现剂量依赖的趋势。启动子的活性依不同肿瘤细胞类型而异,在MDA-MB-231细胞中,CXCR4启动子的活性高于Survivin,而在MCF7和T-47D细胞中则相反。尽管总体上讲,CXCR4与Survivin启动子在乳腺癌细胞的活性无显著性差别(P>0.05),但是CXCR4启动子活性在三种乳腺癌细胞中的变异大于Survivin,提示基因治疗中关于肿瘤特异性启动子的选择需要进行个体化分析。继而将BALB/C小鼠作为动物模型,尾静脉注射腺病毒后对其全身重要器官的CXCR4和Survivin启动子活性进行比较评价,结果显示,两者在各器官的活性均较低,表明腺病毒不会在这些器官累积而导致毒性,尤其是Survivin启动子,对肝脏的毒性仅为CXCR4启动子的1/87.46。 总之,启动子CXCR4和Survivin在乳腺癌细胞系中具有特异的转录靶向性,腺病毒系统中启动子Survivin较CXCR4而言,在乳腺癌细胞中的变异小,而且在重要器官肝脏的活性仅为CXCR4启动子的1/87.46,提示其在乳腺癌基因治疗中具有更好的应用前景。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.9

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