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《天津医科大学》 2008年
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甘氨酸对烧伤大鼠失控炎症反应的调控作用及机制研究

杨南竹  
【摘要】: 烧伤脓毒症是严重烧伤的常见并发症,起病急,进展快,可诱发SIRS和MODS,是烧伤死亡的主要原因之一。最近证实,甘氨酸可通过其调控的Cl~-通道促进Cl~-内流引起细胞膜超极化,抑制枯否细胞、中性粒细胞等的活性,从而改善LPS等因素引起的抗炎/致炎免疫失衡,以对抗可能发生的SIRS及MODS。 目的:探讨烧伤大鼠应用甘氨酸拮抗内毒素调控过度炎症反应的作用及机制。 方法: 1.实验动物造模及分组:Wistar大鼠96只(北京军事医学科学院实验动物中心),雌雄不拘:大鼠造成20%深Ⅱ度以上烧伤,伤后6h腹腔注射乳酸钠林格氏液(40ml/kg)延迟复苏,复苏后3h腹腔注射LPS溶液10mg/kg,治疗组在LPS攻击的同时分别给予Gln溶液或Gly溶液1g/3ml灌胃(日本味之素公司)。于相应时相点活杀动物,留取血液标本。造模后将动物按实验设计随机分为4组:单纯烧伤组(A组);烧伤合并脓毒症组(B组);烧伤合并脓毒症、谷氨酰胺治疗组(C组);烧伤合并脓毒症、甘氨酸治疗组(D组),每组再分为四个亚组,即伤后3h、6h、12h、24h,各时相点n=6。 2.炎性细胞因子测定:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组大鼠血浆炎症细胞因子TNF-α、抗炎因子IL-10水平,并计算各时相点TNF-α/IL-10值;采用鲎实验基质显色定量测定法测定各处理组大鼠血浆LPS水平。 3.PMφ的制备:Wister大鼠腹腔内注射Hank's液20ml,开腹吸出灌洗液。离心、弃上清,用RPMI-1640(10%FBS)培养基混悬后,培养4h(5%CO_2,37℃)。弃培养基,再加入新鲜RPMI-1640(10%FBS)培养基,温育12h待用。 4.单细胞[Ca~(2+)]_i的检测: ①荧光探针的负载:以Fura-2做Ca~(2+)的荧光指示剂。将PMφ培养液与负载液配成细胞悬液后静置50min后,充分洗掉未负载的Fura-2/AM。再于每个样品槽中加入1ml的m-HBSS液(10%FBS),待测。 ②[Ca~(2+)]_i的检测:使用单细胞[Ca~(2+)]_i荧光图像分析系统检测PMφ[Ca~(2+)]_i。将负载好的细胞放于倒置显微镜的载物台上避光检测。用CCD实时拍摄细胞内荧光强度动态变化,Matefluor分析软件进行实时采集和分析。 结果: 1.各组大鼠血浆LPS水平的变化:各组血浆LPS水平3h均升高,A组3h为峰值,B组6h达峰值,C、D组均在12h达峰值,其中B组6h显著高于24h(P<0.05)。各组LPS水平均在24h回落,B组LPS水平在各时相点均显著高于A、C、D组(P<0.05);C组、D组比较无显著差异(P>0.05)。 2.各组大鼠血浆TNF-α水平的变化:A组TNF-α水平进行性升高,观察期内24h为峰值。B、C、D三组3h即达峰值,而后逐渐下降,24h最低;B组观察期内各时相点血浆TNF-α均显著高于A组(P<0.05);在12h、24h两时相点显著高于C组、D组(P<0.05);C组在6h、12h、24h显著低于D组(P<0.05); 3.各组大鼠血浆IL-10水平的变化:B组在3、6h略升高,C组、D组显著较A、B组升高。6h、12h、24hD组IL-10水平显著高于C组(P<0.05)。 4.比较不同时相点TNF-α/IL-10值,B组在各时相点均高于A、C、D组,3h至峰值,其后逐渐下降,并基本维持在较高水平,A、C、D三组TNF-α/IL-10值均在基线附近。 5.Gly对LPS刺激的PMφ[Ca~(2+)]_i的动力学影响: ①在胞外有钙([Ca~(2+)]_o=1.25mmol/L)条件下,不同浓度的LPS均诱导[Ca~(2+)]_i呈单峰状明显升高,并且随着LPS浓度增加而增加;Gly能够剂量依赖性的显著抑制LPS刺激的PMφ[Ca~(2+)]_i升高。 ②在胞外无钙([Ca~(2+)]_o=0)的条件下,LPS刺激的PMφ[Ca~(2+)]_i峰值是胞外有钙条件下的44%;Gly对LPS刺激的PMφ[Ca2+]i动力学无明显的影响。 结论: 1.成功复制20%深Ⅱ度大鼠烧伤模型和烧伤后脓毒症大鼠模型,LPS组各观察时相点LPS水平显著高于Burn组。 2.Gly具有拮抗LPS,抑制炎症介质过度释放,调控致炎因子与抗炎因子的平衡作用。 3.Gly调控烧伤脓毒症大鼠炎症反应的机制:实验研究表明,对受到LPS攻击后的实验烧伤大鼠给予Gly灌胃,能显著抑制肠道内毒素移位,使血浆LPS水平显著降低。 4.体外实验研究表明:甘氨酸剂量依赖性的显著抑制LPS刺激的PMφ[Ca~(2+)]_i升高,且这种抑制作用主要源于对胞外钙内流的抑制。甘氨酸通过抑制LPS诱导的胞外钙内流从而抑制[Ca=~(2+)]_i升高,是其抑制TNF-a释放的主要机制。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R644

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