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《天津医科大学》 2008年
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衣原体噬菌体Vp1蛋白的表达、提纯及杂交瘤细胞的培养

胡春艳  
【摘要】: 衣原体(Chlamydia)已越来越成为人类疾病的重要病原体,曾引起全世界范围内沙眼的广泛流行,造成严重的危害,迄今仍是一些发展中国家致盲的首要原因。噬菌体(bacteriophage;phage)是一群能特异地感染宿主细菌,可将其裂解的病毒,它不仅在分子生物学研究中起重要作用,作为抗菌剂治疗细菌感染正日益受到重视。衣原体噬菌体是微病毒,目前只是在肺炎衣原体、流产衣原体、鱼类衣原体等数种衣原体中发现有噬菌体的存在,研究显示组成衣原体噬菌体壳的衣壳蛋白主要成分是Vp1、Vp2和Vp3,其中Vp1是最主要的结构蛋白,在噬菌体对衣原体的黏附和植入中可能有重要作用。同时该蛋白高度保守而特异,因而是在其它衣原体种—尤其是沙眼衣原体寻找衣原体噬菌体的良好标志物。本课题旨在研究分离和纯化后的Vp1蛋白的免疫原性,探索制备Vp1蛋白的单克隆抗体,为进一步研究其单克隆抗体的临床意义及Vp1蛋白与衣原体作用的相关机制奠定基础,并通过纯化的Vp1蛋白和由此得到的Vp1单抗进行临床筛查,试图发现沙眼衣原体噬菌体的存在。 目的:表达、提纯衣原体噬菌体Vp1蛋白,免疫小鼠,制备杂交瘤细胞。 方法:培养带有vp1-pET-30a(+)重组质粒的大肠杆菌BL21,通过IPTG进行诱导表达,进行超声波碎菌后,用6M脲溶解。将离心、重悬后的蛋白经0.45μm孔径滤器过滤后溶液清亮,然后经过含有镍离子的透析柱透析,用bindingbuffer、washingbuffer依次清洗透析柱,洗脱杂蛋白,最后用stritebuffer将结合在镍离子上的Vp1蛋白洗脱下来,复性后经SDS-PAGE电泳鉴定。 将复性后的Vp1蛋白进行蛋白定量,将约70μg蛋白注射于4周龄的BALB/C小鼠的腹腔内进行免疫,一月后取其内眦静脉血,将其作为一抗,以羊抗小鼠IgG为二抗,进行Western-blot。取追加免疫三天后的小鼠的脾细胞,与骨髓瘤细胞以10:1的数量混合后,进行细胞融合,将融合后的细胞加到含有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板内,在37℃含二氧化碳的温箱中孵育。取经过HAT、HT筛选后杂交瘤细胞的上清液进行ELISA,检测是否含有特异性抗体。 结果:带有vp1-pET-30a(+)重组质粒菌BL21经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳和Western Blot,均显示从细菌裂解物离心沉淀中能获得约70kD的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1,提纯后在SDS-PAGE上的可显示单一的条带,说明提纯后的Vp1蛋白纯度较高。Western-blot在70KD大小处有清晰的目的条带,这说明免疫后的小鼠血清中含有抗Vp1蛋白的抗体。取加强免疫后的小鼠的脾脏,与骨髓瘤细胞进行融合,形成了杂交瘤细胞,并且能够分泌一定的抗体。 结论:1、含有vp1-pET30a(+)重组质粒的大肠杆菌经诱导后能够表达衣原体噬菌体Vp1衣壳蛋白。2、Vp1蛋白分离纯化成功。3、纯化后的Vp1蛋白具有免疫原性,用Vp1蛋白免疫小鼠后小鼠血清中能够产生针对Vp1蛋白的抗体。4、免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞能够进行细胞融合,融合后的杂交瘤细胞既能够进行体外培养,又能够分泌Vp1的特异性抗体。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R392

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