促红细胞生成素在小鼠视网膜血管发育与新生血管增殖中表达的研究

【摘要】： 研究目的:已知促红细胞生成素(EPO)具有血管生成素活性,但其对眼血管生成的作用还不清楚。临床研究表明外源性给予重组人促红细胞生成素(rHuEPO)可能促进早产儿视网膜病变(ROP)的发生和发展。因此,本研究通过建立氧诱导的视网膜病变鼠模型,观察内源性EPO在视网膜血管发育和新生血管形成中的蛋白动态表达情况,并与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达规律相比较,以期初步研究EPO在ROP病变发展中的作用。 研究方法:健康生后7天(P7)C57BL/6J幼鼠32只,随机分为模型组、对照组和正常发育组。其中10只建立高氧诱导模型作为模型组;对照组10只和正常发育组12只于自然环境饲养;前两组于生后12、17天各处死5只;正常发育组于生后9、12、15、18天各处死3只。采用视网膜铺片和ADP(二磷酸腺苷酶)染色、病理切片常规HE染色及免疫组织化学检测方法,分别观察视网膜血管的改变、视网膜新生血管内皮细胞核数目及EPO和HIF-1α蛋白的表达情况。Olympus显微摄像系统采集图片,图像分析软件进行蛋白的累积光密度(IOD)值测定。对IOD值进行分析和比较,实验数据以均数±标准差((?)±s)表示,用SPSS12.0软件包处理。正常发育组不同时限的光密度值采用方差分析:模型组和对照组间采用成组设计的t检验;同组两种蛋白表达的相关性,采用Pearson相关性分析。 研究结果: 1、视网膜新生血管分析 ADP染色视网膜铺片显示:正常发育组和对照组随着鼠龄的增加,视网膜完全血管化;模型组P12时视网膜血管的中心区和中周部出现无灌注;P17时在中周部灌注区与无灌注区的连接处出现新生血管丛。HE染色也显示模型组P12时视网膜周边部血管淤滞,神经纤维层存在血管闭锁;P17时毛细血管于神经纤维层和内核层明显增殖,并突破内界膜进入玻璃体内,在视网膜前形成新生血管。 2、正常发育组不同时限视网膜EPO蛋白表达 EPO的阳性反应产物呈棕黄色点状或颗粒状。在视网膜神经节细胞层及神经纤维层可见EPO阳性颗粒。正常组EPO随视网膜血管发育呈动态表达,P9时其IOD值为8.52±0.92,P12有明显升高,达到20.85±0.72,以后三个时段之间没有明显差异,持续在较高水平。 3、高氧诱导模型视网膜EPO蛋白表达 对照组P12、P17视网膜神经节细胞层及神经纤维层可见EPO蛋白表达;模型组P12视网膜各层及内界膜附近棕黄色颗粒明显减少,P17可见EPO蛋白表达显著增加,位于视网膜神经节细胞层、内核层及突破内界膜的新生血管,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。 4、高氧诱导模型视网膜HIF-1α蛋白表达 HIF-1α的阳性反应产物呈棕色。对照组P12、P17及模型组P12视网膜各层及内界膜附近未见HIF-1α阳性颗粒。模型组P17可见HIF-1α蛋白表达在神经节细胞层和突破内界膜的新生血管,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。 5、EPO和HIF-1α蛋白表达相关性 对模型组P17幼鼠视网膜EPO和HIF-1α两种蛋白的IOD值进行相关性分析。模型组P17的EPO和HIF-1α蛋白的IOD值呈正相关(P＜0.05)。 结论 1.视网膜EPO蛋白表达与视网膜血管发育有一定的时空关系,我们推测EPO可能参与正常视网膜血管发育过程。 2.EPO在模型组不同时间位点的动态表达变化与ROP的两期病理变化相一致,我们推测EPO可能参与ROP视网膜新生血管增殖过程 3.在视网膜新生血管增殖中EPO与HIF-1α蛋白表达呈正相关,推测HIF-1α可能参与缺氧状态下视网膜新生血管增殖中EPO的调节过程。 4.EPO在视网膜新生血管增殖中的作用,有可能为ROP的预防和治疗找到全新的干预靶点,尤其在rHuEPO已广泛用于临床治疗早产儿贫血时,更应该警惕EPO对早产儿发生ROP的影响。