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《天津医科大学》 2008年
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OSAHS的炎性损伤及与高血压和动脉粥样硬化关系的基础研究

冯靖  
【摘要】: 目的在第一部分中建立阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)模式间歇低氧(IH)/再氧合(ROX)气体环境模型,而后,应用这一模型探讨①OSAHS模式IH以及持续低氧(CH)暴露时内皮细胞培养基中炎性分泌蛋白的变化[白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)](研究1),②内皮细胞转录因子和细胞表面炎性蛋白的变化[核因子κB(NF-κB)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)](研究2)以及③内皮细胞转录因子的核内转位情况[核因子κB(NF-κB)](研究3)。在第二部分中阐述不同间歇低氧(IH)程度、IH时间和再氧合(ROX)时间以及持续低氧(CH)模式家兔在体颈动脉体(CB)和颈总动脉在体模型建立过程。而后,应用该模型探讨①IH时家兔颈总动脉内皮炎症状态及其与瘦素的相互关系(研究1);并探讨②不同频率IH/ROX暴露后家兔CB的氧化应激、炎症状态、内皮素水平和CB窦神经(CSN)的传入活性(研究2)。材料与 方法第一部分中由计算机程序在细胞培养舱中产生相应的IH或CH暴露条件,将人脐静脉内皮细胞可传代细胞株ECV304暴露于该条件。①在研究1中,将暴露细胞株分为间歇正常氧(IN)组,IH组,IH高碳酸组,CH组,CH高碳酸组,CH累加IH组,不同IH程度组,不同IH频率组和不同IH时限组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养基中IL-6和TNFα的水平。②在研究2中,将ECV304细胞株暴露于IH/ROX环境60次循环。暴露时按IH/ROX时段将细胞分为11组,每组样本数为12。A组:采用21%O_2 15 s/21%O_2 3 min 45 s方案(即间歇正常氧);B组:置于标准孵箱中不加暴露(标准孵育);C组:采用1.5%O_2 15s/21%O_2 3 min 45 s方案;D组:采用10%O_2 15 s/21%O_2 3 min 45 s方案;以下固定IH方案为1.5%O_2 15s和ROX程度21%O_2不变,IH/ROX循环频率分别为每小时12次(即为C组)、9.23次(E组)、6.32次(F组)、20次(G组)和40次(H组);I组:采用1.5%0O_ 30 s/21%O_2 3 min 45 s方案;C组完成暴露后放回标准孵箱中60 min为J组而120 min为K组。采用ELISA法和细胞表面ELISA法测定细胞裂解液中总NF-κB水平和细胞表面ICAM-1浓度。③在研究3中,暴露细胞株分为7组,每组样本数n=12,分别为IN组;IH组,CH组(15 min和30 min两个组);CH累加IH组;IH恢复组;CH恢复组。ELISA法测定细胞中核内外NF-κB水平。第二部分中成年雄性新西兰大耳白家兔(2.5-3.0 kg)游离右侧颈总动脉和CSN,显露CSN化学感受性神经细束并安放电极记录CSN传入活性。结扎右侧颈总动脉向心端血流,并向右侧颈总动脉远心端内插入导管,经蠕动输液泵交替灌注以发泡法预平衡IH/CH灌注液。监测CSN传入活性,完成暴露后游离收集CB和插管远心端的颈总动脉及其分叉。①研究1中,将60只家兔分为六组,每组10只,分为A.间歇正常氧(IN)组;B.重度IH组;C.轻度IH组;D.重度IH+瘦素组;E.CH组;F.单纯瘦素培养组(Lep组)。暴露后剪下远端颈总动脉,纵向剖开刮取内皮细胞层。标本一部分以非放射性凝胶迁移实验测定IN组、重度IH组、轻度IH组和CH组核抽提物中核转录因子κB(NFκB)DNA结合活性。IN组、重度IH组、重度IH+Lep组和Lep组的另一部分于标准孵箱培养2小时,培养时在重度IH+Lep组和Lep组培养孔中加入人重组瘦素(终浓度10 ng/ml)。以ELISA法测定培养基中白细胞介素-6(IL-6)浓度。以逆转录.聚合酶链反应测定内皮细胞Ras同源物A(RhoA)mRNA表达水平。②研究2中,将49只家兔分为7组,每组7只,分为A.间歇正常氧(IN)组;B.IH/ROX频率为10次/小时组(10·hr~(-1)组);C.IH/ROX频率为30次/小时组(30·hr~(-1)组);D.IH/ROX频率为50次/小时组(50·hr~(-1)组);E.IH/ROX频率为60次/小时组(60·hr~(-1)组);F.IH/ROX频率为90次/小时组(90·hr~(-1)组);G持续低氧组(CH组)。暴露完成后采集CSN化学感受性神经细束传入活性的频率(Charge F),而后游离收集右侧CB,以ELISA法测定CB裂解液中白细胞介素-6(IL-6)、内皮素-1(ET-1)、低氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的浓度并标化。所有研究均用SPSS统计软件包统计学分析。结果第一部分①研究1中,IN组IL-6和TNFα水平为(374.06±38.10)和(31.96±13.64)pg·ml~(-1)·100mg蛋白~(-1),而IH组2的IL-6和TNFα水平为(770.40±21.60)和(126.93±2.58)pg·ml~(-1)·100mg蛋白~(-1),明显高于IN组(均U=0.000,P=0.002);IH高碳酸组IL-6水平为(829.27±7.16)pg·ml~(-1)·100mg蛋白~(-1),高于IH组2(U=0.000,P=0.002)。CH高碳酸组的IL-6均明显高于相同经时反应进程的CH组(均U=0.000,P=0.002),CH累加IH组IL-6和TNFα水平为(536.74±14.97)和(51.10±6.80)pg·ml~(-1)·100mg蛋白~(-1),高于IN组却低于IH组2(均χ~2=23.4,P0.05)。IL-6和TNFα水平随IH程度加重而增加(均χ~2=23.4,P0.05),不同IH频率组的IL-6和TNFα水平则呈现出复杂变化。②在研究2中,C组NF-κ3和ICAM-1水平分别为(0.8218±0.2760)、(1561.86±55.81)pg/ml,A组分别为(0.3668±0.0743)、(768.11±79.46)pg/ml,两组比较差异有统计学意义(分别为D=225,P0.01和D=176.04,P0.05);D组分别为(0.6574±0.2207)、(1112.81±75.99)pg/ml,与C组比较差异有统计学意义(分别为U=25.000和U=0.000,P均0.01);Ⅰ组分别为(0.4450±0.1621)、(1154.88±19.00)pg/ml,C组与Ⅰ组比较差异有统计学意义(分别为U=27.000和U=0.000,P均0.01);同时,C组在不同IH频率各组的比较中NF-κB和ICAM-1水平办是相对最高的(χ~2分别为35.632和56.893,P均0.01);J组NF-κB水平[(0.6233±0.0534)]与C组比较差异无统计学意义(D=36,P0.05),而K组的NF-κB水平[(0.3050±0.0013)]与C组比较差异有统计学意义(D=234,P0.01)。③在研究3中,IH组核内NFκB的光密度标化(间歇正常氧组%)水平(6.2980±0.2754)明显高于低氧累计时间和程度相同的CH组(1.1680±0.3626);无论核内NFκB水平还是培基IL-6浓度,CH累加IH组均低于IH组[分别为(3.5077±0.3497)vs.(6.2980±0.2754)和(536.74±14.28)vs.(770.40±20.59)pg/ml/100 mg蛋白];经过120 min恢复,IH组核内NFκB仍未恢复至对照组水平[(2.7683±0.3968)vs.(1.0000±0.4855)],而CH组核内NFκB水平始终没有明显变化[(1.1680±0.3626)vs.(1.0000±0.4855)];胞浆NFκB水平在各组间无差异。第二部分①研究1中,各组NFκB DNA结合活性差异明显(F=112.428,P0.001);重度IH组该活性(4.27±0.64)高于轻度IH组(2.33±0.45)(标准误=0.2481,P0.001)、IN组(1.00±0.26)(标准误=0.2191,P0.001)和CH组(1.15±0.36)(标准误=0.2329,P0.001)。各组RhoA mRNA表达水平差异明显(F=26.634,P0.001);重度IH+Lep组该表达(2.54±0.53)高于重度IH组(1.57±0.44)(标准误=0.21 83,P=0.002)、IN组(1.00±0.31)(标准误=0.1937,P0.001)和Lep组(1.31±0.30)(标准误=0.1930,P0.001)。各组培基IL-6浓度差异明显(F=79.922,P0.001);重度IH+Lep组IL-6浓度(1591.50±179.57 pg/ml)高于重度IH组(121 7.20±320.62pg/ml)(标准误=0.3572,P=0.036)、IN组(325.40±85.26 pg/ml)(标准误=0.1931,P0.001)和Lep组(517.40±183.09 pg/ml)(标准误=0.2491,P0.001)。②研究2中,IL-6、ET-1和Charge F的整体均数呈现出先升后降的趋势,50·hr~(-1)组的IL-6、ET-1和Charge F水平均高于其余各组(与IN组、10·hr~(-1)组、30·hr~(-1)组、60·hr~(-1)组、90·hr~(-1)组和CH组相比较,标准误和P值分别为:IL-6:5.582、7.760、6.396、6.636、7.748和7.066,P均0.001;ET-1:1.445、1.637、1.771、1.771、1.710和1.692,P均0.00 1;Charge F:0.006788、0.008099、0.006819、0.007601、0.006732和0.008433,P均0.001。),且Charge F与IL-6和ET-1良好相关(与IL-6:r=0.736,P0.01;与ET-1:r=0.757,P0.01,Spearman's等级相关。)。HIF-1水平逐渐增加,CH组HIF-1水平是最高的(与IN组、10·hr~(-1)组、30·hr~(-1)组、50·hr~(-1)组、60·hr~(-1)组和90·hr~(-1)组相比较,标准误和P值分别为:7.173、7.127、7.179、7.629、8.923和8.481,P均0.001。)。CH组VEGF水平增加最为明显(与IN组、10·hr~(-1)组、30·hr~(-1)组、50·hr~(-1)组、60·hr~(-1)组和90·hr~(-1)组相比较,标准误和P值分别为:9.630、10.081、10.512、9.783、10.318和11.773,P均0.001。)。结论第一部分结论为IH/ROX可对内皮细胞造成具有程度依赖性的炎性损伤,其损伤程度明显强于CH且不易恢复,即使IH暴露结束以后,炎症反应的基础在相当长时间内仍持续存在,这种IH/ROX损伤在伴有高碳酸暴露时程度更加严重;IH/ROX对内皮细胞的炎性损伤来源于ROX时段而非来源于IH时段,是ROX时相而非IH时相导致NFκB总含量增加且核内转位,诱导炎症产生;中度频率的IH/ROX将选择性激活细胞炎性通道,而过高频率和过长时段的IH反而激活细胞适应性通道。第二部分结论为IH/ROX明显激活内皮炎性通道,其作用强于CH且存在程度依赖性。当IH/ROX与瘦素共同暴露时有协同作用,炎症反应更加明显,并使内皮层通透性增加。IH/ROX暴露后CB CSN传入活性明显增强并与CB炎症和血管收缩密切相关,CB的炎症来源于ROX时段而非来源于IH时段。这种反应将导致高交感神经张力,在高血压发病中将起至关重要的作用。这一过程受到IH/ROX频率的影响。随着IH/ROX频率的不断增加,CB炎症状念、内皮素水平和CSN长期易化先是逐渐增加,而后再逐渐下降。而HIF-1和VEGF是IH/ROX的适应性通道成员。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R56;R544.1;R543.5

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