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《天津医科大学》 2009年
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致肾盂肾炎大肠杆菌新基因R049的鉴定和特性的研究

葛新  
【摘要】: 【目的】 从国内临床分离的致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)132中发现与致病性相关的新基因,并初步了解其特性,为进一步研究UPEC致病机制奠定基础。 【方法】 1.采用PCR方法对UPEC132特异性编码序列R049片段(789bp)在UPEC菌株和正常人粪便分离大肠杆菌菌株中的分布进行分析。R049片段阳性的菌株经脉冲场凝胶电泳后转膜进行Southern杂交,确认R049片段在受试菌株染色体的分布特征。 2.采用基因组步移技术,以R049片段(789bp)为核心双向延伸,获得其5’端和3’端侧翼序列,经生物信息学分析寻找可能的开放阅读框R049-ORF,并提交GenBank注册。 3.构建原核表达系统E.coli BL21(DE3)/pET32a-R049,SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况,镍亲和层析纯化后的R049重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定血清效价。以此抗血清对UPEC132全菌裂解物以及提取的UPEC132内膜与外膜蛋白进行Western blot分析。 4.观察UPEC132对人膀胱移行上皮细胞(EJ)的黏附,并且用激光共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白标记的UPEC132是否能够侵入EJ细胞内部。采用22KHuman Genome Array基因芯片检测UPEC132感染的EJ细胞的基因表达谱变化,分析感染过程中涉及的信号转导途径。相比之下,构建R049-ORF真核表达质粒,将其转染EJ细胞,检测基因表达谱的变化,分析差异表达基因的功能。 5.以大肠杆菌无菌毛株K-12 p678-54构建表达R049-ORF的重组菌E.coliK-12 p678-54/pACYC184-R049,该重组菌与E.coli K-12p678-54分别经尿道逆行感染BALB/c小鼠,通过小鼠尿液与肾组织细菌计数和肾脏病理学检查观察两种菌株对动物致病性的差异。同时以R049重组蛋白免疫BALB/c小鼠,对免疫组小鼠和未免疫组小鼠经尿道逆行感染UPEC132,通过上述检测分析R049-ORF编码蛋白对同源性菌株攻击的免疫保护作用。 【结果】 1.R049片段(789bp)在20株UPEC和40株正常人粪便分离的大肠杆菌中阳性率分别为40%(8/20株)和7.5%(3/40株),两者有显著性差异(P<0.01)。11株R049片段阳性的菌株经脉冲场凝胶电泳和Southernblot分析,其中有6株UPEC阳性杂交带均为350kb,与国外模型菌株UPEC J96阳性杂交带不同,提示R049片段在国内UPEC中具有共同聚集性分布的特征。 2.对R049片段(789bp)双向延伸,获得其5’端1502bp和3’端1207bp,经生物信息学分析获得一个可能的R049-ORF(1311bp),经BLAST搜索未发现与之相似序列,GenBank注册号为EF488001。 3.R049重组蛋白表达量占菌体总蛋白26.2%,表达产物以包涵体形式存在,镍亲和层析纯化后其纯度大于95%。纯化的R049重组蛋白制备的抗血清,效价达1:102400以上。经Western blot检测,该抗血清与UPEC132全菌裂解物和UPEC132的外膜蛋白发生特异性结合,阳性条带与R049-ORF编码蛋白预测分子量(47 KD)相一致,表明R049-ORF系编码UPEC132外膜蛋白的基因。 4.UPEC132对EJ细胞黏附率为(73.20±5.26)%,共聚焦显微镜观察发现该菌能够侵入EJ细胞内。UPEC132感染的EJ细胞有29个差异表达基因(1个下调,28个上调),主要涉及细胞增殖与生长、炎症反应和细胞凋亡,分属MAPK信号途径、Toll样受体信号途径和诱导细胞凋亡的FNF受体途径。R049-ORF转染的EJ细胞IL-6基因上调大于2倍,与炎症反应有关。 5.分别以重组菌E.coli K-12 p678-54/pACYC184-R049与E.coli K-12p678-54感染小鼠,尿液与肾组织细菌计数和肾脏病理学改变无明显差异。R049重组蛋白免疫小鼠的血清抗体效价为1:25600-1:51200,免疫组小鼠尿液和肾组织细菌计数均显著小于未免疫组(P<0.01,P<0.05),但两组各有部分小鼠肾脏出现严重炎症反应,无明显差异。提示R049基因未表现出致病性,但R049基因编码蛋白对同源性菌株的攻击具有一定的免疫保护作用。 【结论】 1.UPEC132新基因R049特异性地与UPEC菌株相关。 2.R049-ORF(1311bp)编码UPEC132的外膜蛋白(47KD),经NCBI数据库查询和BLAST比对尚无相同报道。 3.R049-ORF转染EJ细胞,IL-6表达上调,R049基因可能涉及炎症反应。 4.动物实验结果显示R049编码蛋白对同源菌株的攻击有一定的保护作用。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R692.7;R378

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【引证文献】
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【参考文献】
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