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《天津医科大学》 2007年
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环维黄杨星D对大鼠在体回肠的作用及其机制研究

刘晓杰  
【摘要】: 目的: 探讨中药单体环维黄杨星D(CVB-D)对大鼠在体回肠的作用,并进一步从细胞水平上探讨其作用机制。 方法: 1.经十二指肠插管给予不同浓度的CVB-D,利用BL-410生物机能实验系统观察CVB-D对大鼠在体回肠收缩幅度及频率的影响,并预先给予钙通道阻滞药硝苯地平以初步推断CVB-D对大鼠在体回肠的作用机制。 2.采用混合酶法(胶原酶、链霉蛋白酶E、牛血清白蛋白)分离培养大鼠回肠平滑肌细胞,绘制原代培养的平滑肌细胞生长曲线,并利用平滑肌肌动蛋白α-actin免疫组织化学染色进行鉴定。 3.利用MTT比色法测定CVB-D对大鼠回肠平滑肌细胞增殖的影响,通过细胞培养液的LDH检测CVB-D的细胞毒性。 4.应用钙敏感的荧光指示剂Fura-2,于荧光分光光度计上测定CVB-D作用后平滑肌细胞内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]_i),从细胞水平上探讨CVB-D的作用机制。 结果: 1.与生理盐水组比较,CVB-D低、中、高剂量组在给药110min后大鼠回肠的收缩幅度增强,且随着时间延长收缩幅度升高更为显著(P<0.05),并且各组药物之间具有剂量依赖性;而预先给予钙通道阻滞药硝苯地平可拮抗其对回肠的收缩作用(P<0.05);CVB-D对回肠的收缩频率无显著影响(P>0.05)。 2.新鲜分离的回肠平滑肌细胞呈长短不一的梭形或椭圆形,细胞培养48h后,可见细胞已贴壁,3-5d细胞开始增殖,10d后细胞密集,呈峰谷样生长,细胞长成致密单层时即可传代。免疫细胞化学检测结果显示:大部分多角形细胞胞浆内见棕色及浅棕色细颗粒,呈阳性反应,核不着色,呈浅蓝色。可见培养的平滑肌细胞纯度较高,几无成纤维细胞混杂。 3.MTT测定显示,低、中剂量CVB-D对平滑肌细胞有明显的促进增殖作用(P<0.01),而高剂量CVB-D则抑制细胞的增殖(P<0.05)。细胞培养液的LDH检测结果显示,低、中剂量CVB-D组LDH明显低于空白对照组(P<0.01),提示CVB-D对细胞有保护作用,而高剂量组LDH明显高于对照组(P<0.01),提示过高浓度CVB-D会对细胞造成损伤或促进凋亡。 4.当回肠平滑肌细胞悬液细胞外钙([Ca~(2+)]。)为1.5mmol/L时,CVB-D可诱发静息期[Ca~(2+)]_i升高,而预先给予维拉帕米可以抑制[Ca~(2+)]_i的升高,抑制率为17.9%;当[Ca~(2+)]_o为0mmol/L时,CVB-D仍可使[Ca~(2+)]_i升高,而普鲁卡因对[Ca~(2+)]_i升高的抑制率达29.2%。 结论: 大鼠回肠平滑肌受CVB-D刺激后,回肠的收缩幅度明显增加,作用机制可能与增加肠平滑肌细胞[Ca~(2+)]_i有关,而[Ca~(2+)]_i增加主要来源于两个途径,即细胞外Ca~(2+)经电压依赖性钙离子通道内流及肌浆网雷诺定(ryanodine)敏感的贮存Ca~(2+)释放。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R96

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