青藤碱对大鼠DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达影响的实验研究

【摘要】： 目的 观察大鼠早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)中核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活化和部分促炎因子mRNA表达的情况,以及盐酸青藤碱(Sinomenine)对它们的影响。 方法 1.选取成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只,随机分为正常对照组(N组)30只,其余70只采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)化学诱导的方法建立大鼠糖尿病模型,其中1只眼球脱出,2只死亡,3只血糖未达标,将建模成功的64只大鼠随机分组：糖尿病模型对照组(DM组)32只；盐酸青藤碱治疗组(SN组)32只。SN组给予2%盐酸青藤碱100mg/(kg·d)腹腔注射治疗。N组和DM组给予等容积0.9%灭菌氯化钠腹腔注射。每4周监测大鼠血糖和体重。 2.各组分别于4周、12周各处死4只(8眼)大鼠,制作视网膜冰冻切片,用免疫组化方法检测NF-κB在大鼠视网膜内的表达情况,对NF-κB活化水平进行相对定量分析。在40倍光镜下,每张切片随机选择5个不重叠的视野,进行NF-κB活化的阳性细胞计数,每眼计数3张切片,每组8只眼,计算均数±标准差,进行组间比较。 3.各组分别于4周、12周各处死8只(16眼)大鼠,剥取每只大鼠双眼视网膜,随机取1只眼的视网膜,用实时荧光定量PCR方法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2) mRNA表达情况。根据Livak的2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对量,并进行组间比较。 结果 1.DR大鼠模型建模成功率为91.43%。各组间大鼠意外死亡率无显著差异(P0.05)。成模4周、12周时,DM组、SN组体重低于N组(P0.01), DM组与SN组之间无显著差异(P0.05); DM组、SN组血糖高于N组(P0.01),DM组与SN组之间无显著差异(P0.05)。 2.4周和12周时,DM组和SN组NF-κB除了见于神经节细胞的细胞核外,表达空间还扩大到内核层和外核层；NF-κB活化水平高于N组(P0.01)；与4周时比较,12周时NF-κB活化水平略增高,差异显著(DM组P0.05、SN组P0.01)；4周和12周时,SN组NF-κB活化水平低于DM组,差异显著(P0.01)。 3.4周和12周时,DM组和SN组视网膜内IL-1β、TNF-α、MCP-1及COX-2 mRNA水平均比N组增高(P0.01)；与4周相比,12周时DM组和SN组TNF-α及MCP-1 mRNA水平增高,差异显著(P0.01或P0.05), IL-1β和COX-2 mRNA水平略增高,但差异不显著(P0.05)；4周和12周时,SN组IL-1β(P 0.05)、TNF-α和MCP-1 mRNA (P0.01)水平低于DM组,差异显著,COX-2 mRNA差异不显著(P0.05)。 结论 1.STZ诱导的DR大鼠模型成模率高,应用此模型可对DR的病理学、发病机制和药物治疗等多方面进行研究。100mg/(kg-d)剂量盐酸青藤碱腹腔注射对糖尿病大鼠是安全的,在12周观察期内对其体重、血糖变化无明显影响。 2.早期糖尿病大鼠视网膜NF-κB的活化水平增高,在节细胞层、内、外核层有NF-κB的活化。随病程延长,NF-κB持续活化并且呈进行性增高的趋势。盐酸青藤碱在一定程度上抑制了糖尿病大鼠视网膜NF-κB的活化。 3.早期糖尿病大鼠视网膜内IL-1β、TNF-α、MCP-1和COX-2 mRNA水平增高,这些促炎症因子可能在早期DR发病机制中发挥重要作用。盐酸青藤碱可能通过抑制糖尿病大鼠视网膜NF-κB的活化,在转录水平部分地抑制了视网膜内IL-1β、TNF-α、MCP-1 mRNA的表达,但对COX-2 mRNA水平没有明显影响。 4.本研究进一步证实了炎症机制可能在早期DR的发生、发展中发挥重要作用。通过抗炎治疗干预早期DR的炎症过程,可能是一种有前途的治疗方法。