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《青岛大学》 2011年
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C57小鼠氧诱导模型视网膜的血管形态学观察、基因表达谱分析和Edn2功能初探

杨侠  
【摘要】:目的本研究的目的在于全面深化了解氧诱导C57小鼠造模过程中视网膜血管的形态学变化,为准确、充分利用这一模型进行视网膜新生血管疾病研究提供直观、详实的动物模型资料;系统分析C57小鼠视网膜血管发育、分化、增殖以及氧浓度变化情况下视网膜基因表达的变化,筛选视网膜新生血管性疾病发生、发展的关键因素,并应用基因干扰技术初步探讨筛选基因Edn2的作用。 方法针对C57野生型小鼠及氧诱导小鼠,应用FD-2000S进行血管内灌注,取小鼠视网膜按时间点连续铺片,观察C57小鼠视网膜血管发育、分化情况及氧诱导过程中视网膜血管的变化,并进行评分;根据视网膜铺片结果,选择不同时间点,分别为高氧初期、高氧晚期、相对低氧(即常氧)早期、血管增生与发育期、血管发育与成熟期5个实验组,提取高氧诱导及野生型小鼠视网膜RNA,利用小鼠全基因组表达谱芯片进行核苷酸杂交,应用SAM软件筛选差异表达基因,David数据库进行基因注释,对部分筛选结果应用Real-time PCR进行验证。构建筛选的差异基因Edn2的干扰RNA,建立高糖体外模型,通过划痕试验、Western Blot、Real-time PCR、Elisa等方法对Edn2的功能进行初步探讨。 结果视网膜铺片结果显示,C57野生型小鼠出生时无视网膜血管,随日龄增加视网膜血管从视盘发出呈放射状生长,至第7-9天浅层血管长满视网膜。小鼠出生9天左右视网膜血管由浅层向深层分化,约至第16天时三层血管网分化基本完成,直至成年视网膜血管网无明显改变。C57氧诱导小鼠置于高氧环境后,视网膜后极部及中周部迅速出现大范围无灌注区并持续存在。小鼠进入常氧环境后,周边视网膜血管开始向中央及深层生长,在小鼠出氧箱后5-6天时新生血管增生最明显,在生后21-23天时视网膜三层血管网布满视网膜。基因表达谱分析结果显示高氧初期表达异常基因以下调为主,主要参与代谢、血管形态发生和发育、细胞增殖过程;高氧晚期表达异常基因以下调为主,主要参与细胞粘附、对刺激(如光及有机、无机物)的反应、视觉感知和凋亡过程;相对低氧初期表达异常基因以上调为主,主要参与氧化还原、代谢和能量、免疫反应、细胞凋亡、体内平衡、血管增生和收缩、视细胞分化和发育、低氧反应等过程。有6个主要基因Acta2, Edn2, Hmoxl, Vegfa, Gpil, Anxa2参与了血管增生和收缩过程;血管增生与血管发育视网膜比较,表达异常基因以上调为主,主要参与神经系统进程、感觉、对刺激的反应、细胞自稳态、细胞粘附和增殖、血管的进程;发育期与成熟期视网膜相比较,表达异常基因以下调基因为主,主要参与离子转运、细胞内信号级联反应、自稳态过程、视觉感知、神经元的形成和分化、细胞粘附、增殖和定位、细胞凋亡、对刺激的反应、内皮细胞增殖和血管增生过程。Edn2干扰实验显示Edn2与细胞的迁移性相关,并可能对Vegf, Timp2, Vtn等因子有上调作用。 结论C57小鼠氧诱导视网膜病变模型是成熟的视网膜新生血管动物模型,同时也是研究氧变化对组织、血管影响的良好动物模型;基因谱表达分析提供了大量与疾病密切相关但即往未知的生物学信息,有利于全面掌握病变的进程和机制,开拓研究思路;Edn2在视网膜新生血管性疾病中可能起着重要的作用。
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R774.1

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