扇贝多肽对UVB损伤的角质形成细胞的抗氧化和抗凋亡作用

【摘要】：实验目的 以强度为103mJ／cm~2的UVB照射昆明种无毛小鼠皮肤建立动物损伤模型，以强度为30mJ／cm~2的UVB照射HaCaT细胞建立细胞损伤模型。在此基础上研究PCF(扇贝多肽)在UVB损伤角质形成细胞中的抗氧化和抗凋亡作用。 实验方法 动物实验的设计分5组：对照组、UVB模型组、UVB+5％ PCF组、UVB+20％PCF组、UVB+10％VC组。无毛小鼠背部皮肤分别给药1小时后接受103mJ／cm~2UVB照射。以免疫组化检测皮肤角质形成细胞p53蛋白、P物质、EGFR(表皮生长因子受体)和真皮的Ⅰ、Ⅳ型胶原。细胞实验设计分为7组：对照组、UVB模型组、UVB+0.0625％PCF组、UVB+0.125％PCF组、UVB+0.25％PCF组、UVB+0.5％PCF组、UVB+0.1％VC组。HaCaT细胞与PCF或VC孵育1小时后，接受30mJ／cm~2UVB照射。除彗星电泳外，以下实验均于照射后18小时进行：以MTT法评价PCF对细胞生存率的影响；酶化学法测定细胞中的SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、T-AOC(总抗氧化能力)和MDA(丙二醛)；以流式细胞术检测细胞的凋亡率、线粒体膜电位和细胞内游离钙离子浓度；透射电镜观察细胞的超微结构；原位杂交实验检测细胞内p21 mRNA。 实验结果 免疫组化实验揭示了无毛小鼠的皮肤受UVB辐射后，其角质形成细胞表达的p53蛋白增多(P＜0.01)；以5％、20％的PCF和10％VC预处理的小鼠皮肤再接受UVB辐射后，其角质形成细胞表达的p53蛋白比模型组少(P＜0.05)；其中20％PCF抑制p53蛋白表达的效果优于5％PCF，具有统计学意义。103mJ／cm~2的UVB辐射诱导小鼠的真皮层表达大量的Ⅰ型胶原(P＜0.01)，并且杂乱地分布其中。与模型组相比，预先涂以PCF和VC的小鼠皮肤受UVB辐射后，真皮层表达的Ⅰ型胶原减少。PCF的处理使UVB辐射的真皮形态结构更接近正常。然而实验中单次UVB损伤没有改变皮肤的P物质、EGFR和Ⅳ型胶原。PCF能提高UVB损伤的HaCaT细胞内抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT的活性(P＜0.05)，增加总抗氧化能力(P＜0.05)，减少脂质过氧化产物MDA的含量(P＜0.05)。流式细胞术的结果表明PCF在 中文摘要 。.0625%一0.5%范围内剂量依赖性降低UVB诱导的HaCaT细胞的凋亡率 (尸0.01)。同时PCF剂量依赖性减少细胞内游离钙离子和抑制线粒体膜电 位的丧失(尸0.01)。通过透射电镜观察细胞超微结构显示模型组HaCaT细 胞的胞浆有大量空泡状结构，并堆积许多髓样小体。胞桨内的粗面内质网、高尔 基复合体、线粒体等细胞器明显减少，三分之一左右的细胞核染色质成块并聚集 于核周，表现出凋亡的形态学特征。PCF处理的HaCaT细胞的超微结构损伤 程度明显减轻，如胞浆内更少的空泡样结构和更多形态正常的细胞器，少见具有 凋亡形态的细胞，未见凋亡小体等。在彗星电泳中照射UVB的各组的尾素明 显高于正常对照组，有统计学意义(尸0.05);与模型组相比，以PCF与VC处 理的各组细胞的尾素均低。其中PCF处理组的尾素剂量依赖性降低(尸 。.01)。原位杂交的结果提示了所有UVB照射组均表达p21 mRNA。 0.0625%和0.125%PCF组在与正常对照组和模型组相比较时，在统计学上不 能显示出差异;0.25%和0.5%PCF组的p21 mRNA水平低于模型组(尸 0.05)而接近正常对照组(尸.05);PCF剂量依赖性抑制UVB诱导的pZI mRNA转录(P0.05)。 绩论以UVB辐射强度103和30rnJ/cm“为参数，分别在无毛小鼠和 HaCaT细胞上成功建立了动物和细胞损伤模型。PCF有抗氧化作用，具体表现 在:提高T一AOC、SOD、CAT、GSH一PX;降低脂质过氧化产物MDA;真皮I型胶 原的表达与分布更接近正常;减少UVB诱导的DNA损伤。PCF能够减少 UVB诱导的角质形成细胞细胞凋亡。降低细胞内游离钙离子浓度、抑制线粒体 膜电位降低和pZI mRNA的转录、减轻DNA的损伤、下调p53蛋白的表达可能 均参与了PCF的抗凋亡作用。