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《青岛大学》 2007年
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杨梅黄酮对大鼠下丘脑γ-氨基丁酸系统的调制作用及对6-羟基多巴胺损伤大鼠黑质—纹状体系统的保护作用研究

马泽刚  
【摘要】: 在现代社会中,失眠是一种常见的睡眠失调疾病,据统计,约有50%的成年人有过失眠的经历,部分患者发展成为慢性失眠,治疗起来非常困难。目前治疗失眠的药物主要集中在苯二氮卓类γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂以及少量抗抑郁和抗组胺类药物。但是,这些药物都有非常明显的副作用,包括引起头疼、恶心,其残余效应对病人第二天的工作和生活有很大影响,而且会出现停药后反弹的情况。更为严重的是,如果长期服用此类安眠药,将会引起病人对药物的耐受和依赖,从而进入恶性循环。传统的中草药在治疗失眠方面存在着巨大的潜力和优势,但大部分中草药的药理学特性及作用机制都不清楚。近几年来,香港中文大学上皮细胞生物学研究中心从草药中提取出一种有改善睡眠作用的成分,经分离提纯表明,其有效成分是杨梅黄酮。前期实验证实杨梅黄酮能有效地减少实验动物的睡眠潜伏期,增加动物的深度睡眠,而对动物的行为和生物节律没有明显的影响,但其药理学特性及作用机制不清。GABA神经递质系统在睡眠的调节中起到非常重要的作用,目前临床上常用的镇静催眠药物,如Zolpidem等,大都是作用在GABA-A受体起到助眠作用的。实验表明,某些黄酮类化合物也可以作用于GABA-A受体的苯二氮卓(BZ)结合位点从而部分的激活GABA-A受体;也有一些实验报道了某些黄酮类化合物的抗焦虑和抗惊厥样作用。但到目前为止,尚未见杨梅黄酮与GABA-A受体相互作用的报道。本实验应用脑片膜片钳全细胞记录、分子生物学、离子成像等综合技术方法,观察了杨梅黄酮对下丘脑室旁核神经元GABA-A受体介导的抑制性突触后电流(IPSCs)、电压依赖的钙离子通道(VGCC)电流、钾离子通道电流的作用;观察了杨梅黄酮对下丘脑GABA-A受体、组胺受体、Hypocretin受体等基因表达水平的影响;并观察了杨梅黄酮对原代培养的下丘脑神经元细胞内Ca~(2+)浓度的影响。初步探讨了杨梅黄酮对下丘脑室旁核GABA能神经递质系统的调制作用及可能的作用机制。为杨梅黄酮调节睡眠的可能作用机制提供有价值的理论和实验依据。实验结果表明: 1.在记录到的14个细胞当中,杨梅黄酮作用后,下丘脑室旁核神经元GABA-A受体介导的微小抑制性突触后电流(mIPSCs)的半衰减时间显著延长(P<0.01);其中,5个细胞的mIPSCs的频率也有显著增加(K-S检验);3个细胞的mIPSCs的幅度明显降低,1个明显升高(K-S检验)。 2.杨梅黄酮作用后,下丘脑室旁核神经元GABA-A受体介导的自发性抑制性突触后电流(sIPSCs)的半衰减时间显著延长(P<0.01);而细胞的mIPSCs的频率没有明显改变(P>0.05)。 3.苯二氮卓(BZ)结合位点的特异性阻断剂Flumazenil不能抑制杨梅黄酮引起的下丘脑室旁核神经元GABA-A受体介导的mIPSCs半衰减时间的延长,但Ca~(2+)和钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaM-KⅡ)的特异性阻断剂KN-62却能阻断此现象。 4.应用杨梅黄酮后,下丘脑室旁核神经元VGCC电流强度明显增加(P<0.01),电压-电流(Ⅰ-Ⅴ)曲线向超极化方向偏转。进一步的实验表明,应用杨梅黄酮后,高电压激活(HVA)的Ca~(2+)通道电流和低电压激活(LVA)的Ca~(2+)通道电流都有显著增强,结果具有统计学意义(P<0.05)。 5.灌流液中加入杨梅黄酮后,原代培养的下丘脑神经元内Fura-2/AM的荧光强度明显增加,CdCl_2或NiCl_2可以部分的阻断此项作用;应用无Ca~(2+)的灌流液处理细胞时,杨梅黄酮引起的荧光强度增加的现象部分的恢复。 6.下丘脑室旁核神经元有三种放电模式:紧张性放电(tonic fire)、簇状放电(burst fire)和无自发放电(silent neuron)。杨梅黄酮能明显抑制紧张性放电神经元的放电频率(P<0.05);使无自发性放电的神经元的膜电位向超极化方向偏转,结果有显著性差异(P<0.05)。 7.应用杨梅黄酮后,下丘脑室旁核神经元K~+通道电流明显增大(P<0.05);当应用不含有Ca~(2+)的灌流液时,杨梅黄酮引起的此项作用不再出现。 8.腹腔注射杨梅黄酮或GABA-A受体a1亚单位的激动剂Zolpidem 2h后,大鼠下丘脑GABA-A受体a1亚单位的mRNA表达均没有明显变化,处理8h后,a1亚单位的mRNA表达明显下调(P<0.05,杨梅黄酮组;P<0.01,Zolpidem组)。 9.杨梅黄酮或Zolpidem处理大鼠2h后,下丘脑组胺1型受体(H1)和Hypocretin2型受体(Hcrt2)的mRNA表达出现明显下调趋势,但结果没有统计学意义(P>0.05);8h后表达恢复到正常水平。 上述结果表明:杨梅黄酮可以通过增强GABA-A受体介导的抑制性突触后电流从而增强GABA的抑制作用;与Zolpidem不同,杨梅黄酮对GABA-A受体的调节作用机制不是通过作用于GABA-A受体的BZ结合位点实现的。杨梅黄酮可以通过某种作用机制促进VGCC的开放从而引起细胞内Ca~(2+)浓度的增高;而细胞内Ca~(2+)浓度增高介导的CaM-KⅡ的激活又会进一步引起GABA-A受体磷酸化水平的改变,此项作用可能部分的参与到杨梅黄酮对GABA-A受体的调节机制当中。细胞内Ca~(2+)浓度的增高又会激活Ca~(2+)激活的K~+通道,促进K~+的外流而造成细胞膜的超极化,进一步加强了对突触后的抑制作用。在某些实验中,应用杨梅黄酮可以增加mIPSCs的频率,表明其除了在突触后作用于GABA-A受体外,在突触前还可以在某种程度上促进GABA的释放。而分子生物学实验表明,杨梅黄酮还可以调控下丘脑GABA-A受体、H1受体及Hcrt2受体等睡眠相关基因的表达情况。杨梅黄酮对这几种基因表达调控的作用结果与Zolpidem相似。综上所述,杨梅黄酮对下丘脑GABA能神经递质系统的调制作用和Zolpidem不完全相同,其可能通过以Ca~(2+)为核心的调节机制作用于GABA系统,通过加强GABA能神经递质系统的活性起到镇静催眠的作用。本实验对杨梅黄酮调制GABA能神经递质系统作用的研究,为杨梅黄酮参与睡眠调节的作用机制的研究提供了新的理论和实验依据,为把杨梅黄酮开发成一种安全、高效的新型助眠药物提供了新的思路。
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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【引证文献】
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