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《青岛大学》 2007年
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骨髓基质干细胞向肝细胞的定向诱导分化及其机理的实验研究

冯智慧  
【摘要】: 目的:目前认为治疗肝功能衰竭的有效方法是肝器官移植,但由于供肝缺乏和免疫排斥反应,制约了肝移植的应用。骨髓基质干细胞(BMSCs)具有易获得、自我复制能力强、在特定的条件下可向各胚层来源的细胞分化的特点。将BMSCs定向诱导分化成为肝细胞,进行细胞移植,以替代损伤的肝细胞,对肝病治疗有非常重要的临床价值。本实验探索和筛选诱导BMSCs向肝细胞定向分化为的最佳条件、探索Ca~(2+)在BMSCs向肝细胞定向分化过程中的作用、以及体内移植对肝损伤的治疗作用,为临床上应用BMSCs进行细胞移植治疗肝损伤提供实验依据。 方法:用全骨髓法从大鼠骨髓中分离BMSCs,纯化和扩增BMSCs。MTT比色法筛选BMSCs的生长曲线,选择最佳生长状态的BMSCs,培养体系中分别加入肝细胞提取液(G,200μg/ml、500μg/ml)、大鼠和人来源的β-神经生长因子—β-NGF from rat(β-NGF-r,20ng/ml、50ng/ml)、β-NGF from human(β-NGF-h 20ng/ml、50ng/ml)和肝细胞生长因子HGF(50μg/ml)诱导BMSCs向肝细胞分化,通过镜下观察分化细胞的形态、RT-PCR法和免疫细胞化学染色法检测肝细胞的特异性标志物白蛋白(ALB)和a-抗胰蛋白酶(AAT)、吲哚靛青绿(ICG)摄取实验鉴定肝样分化细胞。应用流式细胞技术分别检测BMSCs和G诱导分化细胞内游离[Ca~(2+)]i。将BrdU标记后的BMSCs异体移植入慢性肝损伤和对照组的小鼠体内,免疫组织化学法检测BMSCs在肝内的迁移和分化,血清学指标观察BMSCs移植后对慢性肝损伤的治疗作用。 结果:(1)全骨髓分离培养法是纯化、培养和扩增BMSCs的简便有效方法;BMSCs标准生长曲线表明体外培养扩增第3-5代的细胞具有较高的增殖活力。(2)添加G(200μg/ml,500μg/ml)、β-NGF from rat(20ng/ml,50ng/ml)、β-NGF from human(20ng/ml,50ng/ml)和HGF(50μg/ml)诱导后,分化细胞逐渐趋短变圆呈圆形和卵圆形,圆形细胞可以摄取ICG,呈现绿色。免疫细胞化学染色显示分化细胞呈AAT阳性表达;各诱导组分化细胞的AAT表达显著性高于对照组(P<0.05),其中G、β-NGF组AAT表达强于HGF组(P<0.05),G、β-NGF组间无显著性差异(P>0.05),两种不同来源的β-NGF诱导效果无差异显著性(P>0.05)。(3)RT-PCR结果显示四种诱导剂诱导21d后,分化细胞均表达ALB mRNA。(4)G诱导形成的肝样分化细胞中[Ca~(2+)i较对照组细胞显著性升高(P<0.05),加入尼莫地平可以阻断BMSCs向肝细胞的诱导分化,并影响细胞的增殖活性。(5)BMSCs移植后7d、14d、28d损伤组受体肝脏内均可见BrdU标记的移植细胞,移植细胞大部分呈现由血管逐渐向肝实质内迁移的过程,BMSCs移植后20d、40d的慢性肝损伤小鼠血清学指标与对照组有明显的改善(P<0.05)。 结论:(1)体外培养BMSCs第3-5代的细胞具有较高的活力。(2)G、β-NGF from rat、β-NGF from human和HGF均可诱导BMSCs向肝细胞分化。(3)Ca~(2+)在BMSCs的增殖和向肝细胞定向分化过程中发挥重要作用。(4)静脉移植的BMSCs可迁移至异种动物损伤的肝脏,可以改善受损肝脏的功能。
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R329.2

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