PTEN在CCl_4诱导大鼠肝纤维化和自发逆转肝组织中的动态表达及其与在体肝星状细胞增殖、凋亡的关系

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix, ECM)成分在肝内过多沉积所致。在肝脏受到慢性损伤时,纤维组织生成,如果不及时去除刺激因素,纤维组织则持续增生,从而形成肝硬化。肝纤维化是肝硬化发生发展的必经途径,肝纤维化是可逆的,而肝硬化则难以逆转。因此,研究肝纤维化的发病机制,从而阻断甚或逆转肝纤维化非常关键。 肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝脏窦状隙周围细胞,正常情况下处于静止状态,炎症、损伤等因素可以使其激活,产生大量以胶原为主的ECM成分和各种细胞因子。HSC是肝脏主要的纤维生成细胞,其活化、增殖可以启动整个肝纤维化过程,是肝纤维化形成的中心环节。HSC活化后难以恢复静止状态,肝脏主要通过细胞凋亡机制来去除活化HSC,而这恰是肝纤维化发生逆转的关键所在。因此,抑制HSC活化、增殖,诱导活化的HSC凋亡对逆转肝纤维化意义重大。 第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸至非肿瘤领域。我们的前期研究发现在胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)大鼠肝纤维化模型中,PTEN与在体大鼠HSC活化、增殖呈负相关,与HSC凋亡呈正相关。而PTEN在肝纤维化逆转中的表达改变尚未见报道,本研究旨在阐明PTEN在肝纤维化发病以及自发逆转过程中的表达改变,并探讨其动态表达与HSC增殖、凋亡的关系,从而为寻求有效预防和逆转肝纤维化的新策略提供实验依据。 目的:研究PTEN在大鼠肝纤维化及自发逆转过程中的表达改变及其与在体HSC增殖、凋亡的关系。 方法:使用成年健康雄性Wistar大鼠108只,随机分为模型组(30只)、模型对照组(30只)、逆转组(24只)、逆转对照组(24只),进行四肢轮流皮下注射40% CCl_4橄榄油溶液(2 ml·kg~(-1),2次/周)共5周建立大鼠肝纤维化模型,模型建立成功后停止应用CCl_4并正常饲养4周建立肝纤维化自发逆转模型,正常大鼠作为对照组,造模过程中大鼠无死亡。利用Haematoxylin and eosin staining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法观察肝脏病理学改变,免疫荧光方法检测大鼠肝组织中PTEN及α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;采用免疫荧光双标记法利用激光扫描共聚焦显微镜测定在体活化HSC以及凋亡细胞中PTEN的表达改变;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(TUNEL)及α-SMA免疫荧光双标记方法检测在体活化HSC的凋亡;Western blot和real-time ?uorescent quantitation PCR(real-time PCR)检测PTEN蛋白及mRNA在大鼠肝组织中的表达。 结果:①HE和MT染色结果显示:CCl_4诱导的大鼠肝纤维化模型和自发逆转模型成功建立,随着CCl_4用药时间的延长,肝细胞变性坏死逐渐增多,大鼠肝纤维化程度逐渐加重;在停止注射后,随着自发逆转时间延长,已形成的纤维组织逐渐减少,肝细胞逐渐恢复正常形态,再生肝细胞增多;②α-SMA免疫荧光染色显示:对照组正常大鼠肝组织中,α-SMA仅在血管壁平滑肌细胞有表达,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk和5 wk时大鼠肝组织内α-SMA的累积阳性光密度值(0.51±0.02,0.74±0.02,1.29±0.02,1.40±0.01,1.65±0.02)均显著高于对照组(0.07±0.01),P0.01;且各组之间均有显著性差异(P0.01);而在自发逆转组,随着自发逆转时间的延长,造模Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk和Re 4 wk免疫荧光结果显示α-SMA阳性表达(1.31±0.11, 1.14±0.03, 0.97±0.01, 0.55±0.11)逐渐降低,但仍显著高于对照组(0.12±0.04),并且各组之间有显著性差异,P0.01;③PTEN免疫荧光染色显示:正常大鼠肝组织中PTEN蛋白广泛表达于细胞浆,随肝纤维化进展,PTEN阳性细胞主要分布于纤维间隔、汇管区及增生的胆管周围细胞处。造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠肝组织内PTEN蛋白的阳性光密度值逐渐降低(2.23±0.02, 1.96±0.03, 1.61±0.02, 1.37±0.02, 0.98±0.01)并显著低于对照组(2.67±0.02),P0.01;各组之间均有显著性差异(P0.01)。在逆转组,随着停药时间的延长,PTEN蛋白表达逐渐回升(1.01±0.11, 1.46±0.09, 1.62±0.22, 1.99±0.30),由汇管区表达增加逐渐广泛表达于肝小叶其它部位,但仍低于对照组(2.31±0.12),各组之间具有显著性差异,P0.01;④Western blot分析显示,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白表达量(1.33±0.10, 1.12±0.13, 0.83±0.10, 0.55±0.08, 0.41±0.09) ,均显著低于对照组(1.75±0.32),P0.01;且各组之间比较也均有显著性差异(P0.01),即大鼠肝纤维化越重PTEN蛋白表达越低。在逆转组,造模Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中PTEN蛋白表达量(0.10±0.03, 0.21±0.05, 0.36±0.08, 0.44±0.06),呈逐渐升高的趋势,且各组之间具有显著性差异(P0.01);⑤应用实时荧光定量PCR,采用相对定量2-△△Ct法比较PTEN mRNA在各组大鼠肝组织中的表达,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk肝组织中PTEN mRNA相对对照组的表达倍数为0.67±0.01, 0.58±0.04, 0.48±0.02, 0.38±0.04, 0.28±0.08,均显著低于对照组,并随肝纤维化的加重而逐渐降低,P0.01。而在逆转Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中,PTEN mRNA的相对表达倍数分别为0.53±0.01, 0.74±0.01, 0.80±0.03, 0.93±0.06,仍低于对照组,各组之间均有显著性差异,P0.01;⑥PTEN和α-SMA在HSC的共表达产物,主要存在于活化HSC细胞浆,并且共表达区域以汇管区和纤维结缔组织区域为主,共聚焦激光扫描显微镜图像分析结果显示,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk大鼠肝组织中PTEN表达阳性的活化HSC占总的活化HSC的比例分别为(0.90±0.05, 0.75±0.03, 0.41±0.03, 0.29±0.02, 0.23±0.03)。即随着肝纤维化的进展,活化HSC中PTEN表达逐渐降低。在逆转Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk组中,活化HSC中PTEN表达逐渐上升,并且具有显著性差异(0.35±0.02, 0.57±0.02, 0.66±0.02, 0.71±0.02) (P0.01);⑦TUNEL及α-SMA免疫荧光双重染色显示:正常大鼠肝组织未见凋亡HSC,随肝纤维化程度加重,活化HSC增多,凋亡HSC也随之增多,造模1 wk、2 wk、3 wk、4 wk及5 wk,大鼠肝组织活化HSC凋亡指数(7.12±0.03, 6.35±0.02, 4.11±0.02, 3.68±0.02, 1.50±0.03)显著高于对照组,随着肝纤维化病变加重,活化HSC凋亡的比例逐渐减少(P0.01)。而停药后,随着肝纤维化的自发逆转,活化HSC的凋亡指数显著增加(1.20±0.23, 1.35±0.12, 4.20±0.17, 6.51±0.45, P0.01),凋亡的活化HSC主要集中在汇管区及纤维组织区域;⑧共聚焦激光扫描显微镜下观察TUNEL及PTEN免疫荧光双重染色的大鼠肝组织冰冻切片,正常大鼠和模型1 wk组大鼠肝组织未见凋亡细胞,随肝纤维化程度加重,造模2 wk、3 wk、4 wk及5 wk可见凋亡细胞逐渐增多,PTEN阳性的凋亡细胞比例逐渐降低(0.70±0.01, 0.64±0.01, 0.50±0.02, 0.33±0.01),P0.01。而在逆转组,PTEN阳性的凋亡细胞和凋亡细胞进一步增多,其比例在Re 1 wk、Re 2 wk、Re 3 wk及Re 4 wk中逐渐升高(0.78±0.02, 0.80±0.01, 0.92±0.02, 0.95±0.02);⑨对PTEN免疫荧光染色结果与α-SMA免疫荧光染色结果、PTEN阳性的活化HSC比例、活化HSC凋亡指数及PTEN阳性的凋亡细胞比例进行Pearson’s相关性分析,结果显示,大鼠纤维化肝组织中PTEN表达与α-SMA的表达呈显著性负相关,与PTEN阳性的活化HSC比例呈显著性正相关,与活化HSC凋亡指数呈显著性正相关,与PTEN阳性的凋亡细胞比例呈显著正相关,r值分别为-0.979、0.962、0.991、0.979,P0.05。 结论:CCl4诱导的大鼠肝纤维化病变进展中肝组织及其HSC的PTEN表达下调,而停药后的自发逆转进程中肝组织及HSC的PTEN表达上调,提示PTEN可能通过抑制HSC的活化、增殖和诱导活化HSC发生凋亡而成为治疗肝纤维化的新靶点。