基因激活基质诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

【摘要】：目的:研究将TGF-β1基因真核表达型质粒pCMV6-TGF-β1-GFP与胶原/壳聚糖支架复合,制作成基因激活基质的方法,探索基因激活基质对诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的作用,为关节软骨缺损的修复提供实验依据。 方法: 1基因激活基质的制备:2%的胶原和3%的壳聚糖醋酸溶液按7:3比例混合均匀,倒入模具中,-20℃预冷冻10h,放入冷冻干燥机中冻干24h,在支架上加载pCMV6-TGF-β1-GFP质粒,再次冻干,最后用交联剂在室温下交联2小时,制备成基因激活基质,用扫描电镜和液体置换法检测其孔径大小和孔隙率。 2脂肪干细胞的分离培养和传代:无菌条件下取兔双侧腹股沟处皮下脂肪组织约10毫升,剔除血管后,充分剪碎,0.1%的I型胶原酶在37℃下振荡消化1.5小时,用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基终止消化,200目滤网滤过,离心,弃上清,再用培养基重悬细胞,计数,接种于培养瓶中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。48小时后首次换液,以后每三天换液一次,8-10天达到约80%融合时按1:3的比例首次传代。以后每次待细胞生长至约80%融合时进行下一次传代。 3基因激活基质复合脂肪干细胞体外培养:取第4代脂肪干细胞作为种子细胞,与基因激活基质复合。设置实验组A和对照组B,A组用基因激活基质支架,B组用不含质粒成分的胶原/壳聚糖支架。细胞支架复合物置于12孔板内,用不含胎牛血清的LG-DMEM完全培养基于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养,每3天换液一次。MTT法检测细胞在支架上的生长状况。 4检测基因激活基质的转染效果:支架接种细胞培养24h后,用荧光显微镜观察支架内部是否有绿色荧光发出。培养7d,取标本在EP管中裂解,匀浆,然后添加lml的Trizol,按照说明书提取总的RNA。用RT-PCR检测TGF-β1表达。接种后第1、4、7、10、13d用ELISA法检测培养基中TGF-β1蛋白的含量。 5细胞支架复合物的电镜观察和免疫组织化学检测:培养3d、7d、14d,分别取标本用扫描电镜观察细胞的形态和生长状况,取第14d标本,进行免疫组织化学及生物学的相关检测。 结果: 1基因激活基质的孔径与孔隙率:基因激活基质的孔径约为100-150um,平均为120um左右,孔间相通性好,孔隙率为(86.7±1.5)%。 2兔脂肪干细胞形态学观察:原代脂肪干细胞24h贴壁,细胞呈长梭形或多角形,第3天开始呈克隆样生长,第7-10天达到80-90%融合,传代细胞生长明显加速,5-7天可以达到80-90%融合,生长活跃,并呈典型的漩涡样生长。 3基因激活基质的转染效果:支架接种细胞培养24h后,荧光显微镜观察显示实验组支架内部有绿色荧光发出,这种荧光现象一直持续到14d,而对照组无。培养7d时,取复合物提取总RNA,用RT-PCR检测TGF-β1表达,结果显示实验组有表达,而对照组无。接种后第3、6、9、12、15d用ELISA法检测培养基中TGF-β1蛋白的含量,实验组在7d时检测水平最高,14d时仍有表达,而对照组无。 4电镜观察和免疫组织化学检测:脂肪干细胞与基因激活基质复合48h后,用扫描电镜观察标本,可见基因激活基质表面布满细胞,细胞呈梭形黏附于支架上,孔隙内已有部分细胞呈集落状生长。培养2周后,扫描电镜可见细胞形态向多角形,不规则型转化,体积增大,周围出现较多量细胞外基质。对照组细胞多呈纤维状生长,细胞数量和细胞外基质均较少。Ⅱ型胶原免疫组织化学检测显示:实验组基因激活基质内部细胞呈棕黄色染色,而对照组细胞染色阴性。 结论: 负载有TGF-β1基因真核表达型质粒pCMV6-TGF-β1-GFP的基因激活基质具有良好的细胞相容性和孔隙率,可以负载脂肪干细胞生长,并可以实现对细胞的转染,使细胞表达TGF-β1蛋白,促进自身向软骨细胞分化,具有较好的诱导作用,可以作为软骨组织工程支架。

【关键词】：软骨组织工程 基因激活基质 脂肪干细胞 基因转染 诱导分化
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R684
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