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《河北医科大学》 2011年
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房水微环境对树突细胞成熟状态的影响

王会芳  
【摘要】:目的:眼处于免疫赦免状态和很多因素有关,其中包括解剖因素,如血眼屏障、缺少直接淋巴引流通路等,此外,房水中还存在大量起免疫抑制作用的因子对免疫细胞活性有广泛的调节作用。树突细胞(dendritic cells, DCs)是体内功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),广泛存在于虹膜、睫状体和房水流出通道却没有得到应有的关注。本实验通过在体外模拟炎症反应环境,来观察房水微环境对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)介导的DCs成熟的抑制作用。 方法:取新鲜处死的猪的眼睛,保证球壁完整以防房水被污染和渗漏,用含800U/ml庆大霉素的50%酒精浸泡15min以消毒。于角膜缘处用27G针头刺入前房,使房水自动流入连接的硅化微量离心管,保存于-80°C;应用ELISA法测定房水中PGE_2含量;选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,培养骨髓源DCs,培养基培养7天,半量换液后,1μg/ml的LPS刺激48h,收集悬浮和半贴壁细胞即为成熟的DCs。经流式细胞术鉴定DCs表面特异性分子标记物CD11c以观察细胞纯度。为了研究房水对DCs成熟状态的影响,将未成熟DCs分为三组:对照组(与1μg/ml LPS共培养48h),实验1组(与1μg/ml LPS+25%AH共培养48h),实验2组(与1μg/ml LPS+50%AH共培养48h),并补足rmGM-CSF、培养液,48h后收集细胞,通过流式细胞术做表型和内吞功能的鉴定。尼龙毛柱法分离得到雄性6-8周龄BALB/c小鼠脾脏的T细胞,应用于混合淋巴细胞反应来观察DCs刺激T细胞增殖的能力;根据文献结果于房水中加入10000倍于TGF-β_2浓度的抗TGF-β_2中和抗体(20μg/ml),与DCs作用48h后检测拮抗TGF-β_2后房水对DCs成熟状态的影响;第7天于DCs中加入AH6809(EP2受体拮抗剂)至终浓度为100μM,作用30min,以阻断PGE_2的作用的受体,半量换液加入房水,继续培养48h,观察DCs的成熟状态。实验数据应用SPSS13.0软件包进行统计学分析。 结果:1 DCs培养7天后,可见较多细胞呈半悬浮生长,大量细胞集落形成,集落部分细胞表面出现长短不一毛刺样突起,并可见少量单个悬浮的典型DCs,经流式细胞术鉴定DCs表面特异性分子标记物CD11c细胞纯度达到70%。 2房水抑制DCs表型成熟:对照组呈现出表型成熟状态,表现为高表达MHC-II、CD80、CD86;实验组可见依AH浓度呈剂量依赖性抑制DCs成熟,MHC-II、CD80、CD86相应的MFI明显下降;各组的散点图表明不同处理组并没有影响DCs数量。 3房水抑制DCs功能成熟:流式细胞术检测DCs吞噬FITC-dextran的能力发现,房水呈剂量依赖性抑制LPS介导内吞功能;尼龙毛柱法分离得到BALB/c小鼠脾脏T细胞,经流式细胞术鉴定CD3~+T细胞纯度达到90%;混合淋巴细胞反应中对照组DCs经LPS刺激后表现为强的刺激T细胞增殖能力,实验2组较实验1组刺激T细胞能力则减低,并在1:10比例组可观察到实验2组的刺激能力是对照组1/3。 4阻断细胞因子拮抗房水的抑制作用:经ELISA测得房水中PGE_2的浓度为2603.919±771.1536pg/ml,远远小于10~(-6)mol/L,因此选用EP2受体特异性拮抗剂AH6809预处理DCs1h以阻断PGE_2细胞膜作用通路。培养液中加入房水、抗TGF-β_2中和抗体、AH6809和DMSO并没有影响CD11c的表达,也即各组DCs具有均一性。房水能够显著抑制LPS诱导的DCs MHC-II的高表达,而抗TGF-β_2中和抗体预处理房水后则完全中和房水的抑制作用。尽管封闭EP2受体对房水的抑制作用没有影响,但是内吞功能测定,同时拮抗EP2受体和中和TGF-β_2可以协同提高DCs的内吞功能。 结论:1房水呈剂量依赖性抑制LPS介导的DCs表型和功能的成熟,表现为低表达MHC-II和共刺激分子CD80、CD86,高的内吞功能以及弱的刺激T细胞增殖的能力。 2房水中TGF-β_2在抑制LPS介导的DCs成熟过程中起主导作用。 3房水中基础量PGE_2对LPS介导的DCs表型成熟没有抑制作用,但是可以协同TGF-β_2提高DCs的内吞功能。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

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