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基于液质联用技术的溪黄草多组分分析与药动学特征及冬凌草指纹图谱研究

刘彭玮  
【摘要】:溪黄草和冬凌草为唇形科香茶菜属植物溪黄草与冬凌草的干燥地上部分。该属植物在亚洲东部和非洲西部广为分布,全世界约有150种。我国约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用,作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、抗菌药来使用。人们对该属埴物的二萜类成分作了大量研究,已从中提取了百余种二萜类成分。经药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、抗炎活性作用。迄今,国内外学者对该属植物化学成分鉴定与分离研究为较广泛,而对于其质量评价与体内外代谢研究较少涉及。然而由于香茶菜属植物基源相近,所含化学成分十分类似,对其质量控制及评价十分重要。二萜类是香茶菜属植物中的一类主要活性成分,但由于种类多样且含量较低,使其深入研究受到限制。液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)具有专属、快速、灵敏等优点,是混合物中化学成分定性和定量分析的有力工具。本研究采用HPLC-MS技术建立溪黄草中27种成分同时定量的分析方法,并用于不同产地的溪黄草药材的比较;建立大鼠血浆样品中7种药理作用明确的二萜类成分的HPLC-MS定量分析方法,并用于大鼠灌胃给予北溪黄草提取物后7种成分的药代动力学研究,阐明其药代动力学参数;建立大鼠胆汁样品中12种二萜类成分的HPLC-MS定量分析方法,并用于大鼠灌胃给予溪黄草提取物后12种二萜在胆汁中的排泄研究;采用HPLC-UV法对18批冬凌草药材的指纹图谱进行比较研究,为科学评价与有效控制冬凌草药材质量提供简便、可靠的分析方法。 第一部分液质联用法同时测定溪黄草中27种成分的含量 目的:建立一种快速、准确、可同时测定溪黄草中27种化学成分(18种二萜类成分、6种酚酸和2种黄酮)的HPLC-ESI-MS分析方法,并用于溪黄草药材的分析。 方法:由MRM-IDA-EPI模式对27种化合物结构进行确证,采用MRM正负离子扫描模式建立其含量测定方法,并采用所建立的方法对45批不同产地的溪黄草药材进行分析。质谱条件:ESI源;正负离子同时监测;源喷射电压(IS):5500V(正离子监测模式),-4500 V(负离子监测模式);离子源温度:500℃。雾化气(Gas1):40 psi,加热气(Gas2):50 psi,帘气:25 psi。27种被测成分的监测离子对分别为sodoponin (426.4/331.3), effusanin A (349.3/331.3),enmein (363.3/281.3),lasiodonin (365.3/347.3),epinodosinol (382.3/347.3) , oridonin (365.3/347.3), nervosanin B (384.4/349.3), serrin B (377.4/359.3), isodonoiol (407.4/329.2), shikokianidin (491.4/329.2), rabdosinate (535.4/295.3),epinodosin (361.2/287.1),nodosin (361.1/257.1),ponicidin (361.2/299.1),enmenol (365.2/347.2), lasiokaurin (405.2/58.9), lasiokaurinol (407.3/58.9),原儿茶醛(136.9/107.9),水杨酸(136.9/92.9),阿魏酸(193.0/133.9),咖啡酸(179.3/135.3),绿原酸(353.1/191.0),迷迭香酸(359.0/160.9),槲皮素(301.1/151.0),异鼠李素(315.1/300.3),芦丁(609.5/300.1)。色谱条件:色谱柱:Diamonsil-C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm, Dikma,美国);柱温:25℃;流动相:0.1%甲酸-甲醇(含0.1%甲酸)梯度洗脱;分析时间:15 min;流速:0.7 mL/min。 结果:在测定的浓度范围内27种化学成分均具有良好的线性关系,精密度、准确度、检测限和定量限均符合要求。样品测定结果表明,溪黄草产地、生长环境、采收时间和用药部位均对27种活性成分的含量有影响,对其进行规范化种植是保证其质量的最有效手段。 结论:本法简便、快速、专属性好,可用于溪黄草中27种化学成分的含量测定,该法对于溪黄草药材的质量控制具有重要意义。 第二部分液质联用法同时测定大鼠血浆中7种二萜类成分及其药代动力学研究 目的:建立一种可同时测定大鼠血浆中epinodosin, epinodosinol, nodosin, oridonin, lasiokariurinol, lasiokaurin和rabdoternin A含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃给予溪黄草提取物后7种成分的药代动力学研究。 方法:大鼠灌胃给予溪黄草提取物(10 mL/kg)后,分别于给药后10, 30, 60, 90, 105, 120, 150, 180, 240, 300, 480, 600, 720 min眼内眦静脉丛取血,制备血浆样品,采用乙酸乙酯液液萃取法进行样品预处理,磺胺甲恶唑为内标。色谱柱为C18柱,流动相为0.1%甲酸-甲醇(含0.1%甲酸)梯度洗脱,流速0.7mL/min,运行时间为15.05 min。采用电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,多反应监测(MRM)模式进行检测,同时为了获得较高的灵敏度我们将检测过程分割成5个不同的检测时间段,即多时间段检测模式。这种方法可以实现在一针样品运行中对正负离子同时进行监测。7种被测成分的监测离子对分别为epinodosin (361.2/287.1), epinodosinol (382.3/347.3), nodosin (361.2/257.1), oridonin (365.3/347.3), lasiokaurinol (407.3/329.1), lasiokaurin (405.2/59.0), rabdoternin A (363.2/283.1)和磺胺甲恶唑(254.1/156.0)。 结果:血浆中epinodosin, epinodosinol, nodosin, oridonin, lasiokaurinol, lasiokaurin和rabdoternin A在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,精密度、准确度、检测限和定量限均符合要求。大鼠单次灌胃给予溪黄草提取物后,血浆中该7种成分的药代动力学参数具有一致性,且7种成分的吸收和消除均较快,但epinodosinol, nodosin, oridonin, lasiokaurinol, lasiokaurin和rabdoternin A的达峰时间较epinodosin晚。 结论:该法灵敏度高、选择性好、精密度好,可用于大鼠灌胃给予溪黄草提取物后,血浆中epinodosin, epinodosinol, nodosin, oridonin, lasiokaurinol, lasiokaurin和rabdoternin A的药代动力学研究,该结果可为溪黄草临床用药提供参考依据。 第三部分液质联用法同时测定大鼠胆汁中12种二萜成分 目的:建立一种LC-ESI-MS法同时测定口服溪黄草提取物后大鼠胆汁中12种二萜成分含量的方法,探讨该药在大鼠胆汁中的排泄规律,为二萜类成分自大鼠胆汁中的排泄研究提供测定方法。 方法:大鼠灌胃给予溪黄草提取物(10 mL/kg)后,麻醉进行胆管插管手术,收集0~1 h, 1~2 h, 2~3 h, 3~4 h, 4~6 h, 6~8 h, 8~10 h,10~12 h, 12~20 h, 20~28 h, 28~36h胆汁,采用液液萃取法进行样品预处理,SMZ为内标。色谱柱为C18柱,流动相为0.01%甲酸水-甲醇(含0.01%甲酸)梯度洗脱,运行时间为15 min。采用电喷雾离子源(ESI),正负离子同时监测;源喷射电压(IS):5500 V(正离子监测模式),-4500 V(负离子监测模式);离子源温度:500℃。雾化气(Gas1):40 psi,加热气(Gas2):50 psi,帘气:25 psi。15种被测成分的监测离子对分别为effusanin A 349.3/331.3, nodosin 363.3/253.1, enmein 363.3/281.3, lasiodonin 365.3/347.3, epinodosinol 382.3/347.3, oridonin 365.3/347.3, rabdosinate 535.4/295.3, epinodosin 361.2/287.1, pinodosin 361.2/363.2, lasiokaurin 405.2/59.0, lasiokaurinol 407.3/329.1, Hebeirubesensin K 365.2/299.2和磺胺甲恶唑254.1/156.0。 结果:胆汁中12种化学成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,精密度、准确度、检测限和定量限均符合要求。12种分析物的日内、日间相对标准偏差(RSD)分别小于7.9%和9.5%,准确度相对误差(RE)为-9.6%~8.9%。提取回收率均均处于88.9%~108.7%范围内。大鼠灌胃给予溪黄草提取物10 mL/kg后在0~36 h内,10种二萜(1-4、6-10、12)由胆汁排泄的累积排泄率大于0.0001%,分别为:0.0302%、0.6361%、2.6722%、0.0165%、0.0371%、0.0126%、0.0032%、0.0445%、0.04727%、0.000332%、0.0565%;其余2种二萜(5、11)累积排泄率小于0.0001%。 结论:该方法专属性强,准确可靠,灵敏度高,可满足大鼠口服给予溪黄草提取物后胆汁排泄研究中药物浓度测定的要求,该结果可为溪黄草临床用药提供参考。 第四部分不同产地冬凌草药材的指纹图谱研究与PCA分析 目的:研究并建立不同产地冬凌草药材的指纹图谱,为科学评价与有效控制冬凌草药材质量提供可靠的方法。 方法:采用HPLC-UV对18批冬凌草药材的指纹图谱进行比较研究,同时应用2种不同的分析方法(主成分分析法和相似度分析法)对实验数据进行处理,以找出来自4个不同产地18批中药冬凌草样品间的相似性及差异性。色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),柱温为30℃;检测波长为238 nm,流动相为甲醇-乙腈-0.05%磷酸水进行梯度洗脱,流速0.8 mL/min。 结果:建立了不同产地冬凌草药材HPLC-PDA指纹图谱共有模式,标定19个共有峰,两种模式识别方法均能成功地按样品的来源将不同产地的样品正确分类。 结论:本方法操作简便、快速、准确,建立了不同产地冬凌草药材的识别方法,可有效地控制冬凌草药材的质量,并对其它中药材质量控制具有指导价值。


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