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《河北医科大学》 2011年
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钙化血管平滑肌细胞中CaN对PKGI的调节作用

孙鹏  
【摘要】:目的:血管钙化是多种疾病的病理基础,与动脉粥样硬化关系最为密切,它使动脉机械性质发生了改变,可造成血栓的形成、粥样斑块的破裂、外周血管堵塞缺血、主动脉狭窄、心肌缺血和梗死等严重后果,增加了气囊血管成形术中血管破裂和心血管生物修复术失败的风险。导致心脏瓣膜钙化的主要原因是机械损伤和炎症,累及的主要部位在主动脉瓣和二尖瓣,钙化的结果可致瓣膜狭窄和/或返流,是心脏瓣膜置换术的重要原因所在。以上所述的血管以及心脏瓣膜的钙化是心血管发生钙化的常见部位。 以往认为血管细胞钙化是钙盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积,是血管细胞老化的标志,然而新近的研究发现血管细胞钙化是一个复杂的、主动的、可调控的生物学过程,是活跃的血管结构的骨化,类似于骨和软骨形成过程中的骨化。 钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN广泛分布在多种组织细胞中,是一种多功能信号酶,主要通过使NFAT等底物的去磷酸化及核内转位,激活下游基因使其转录,参与调节多种细胞的功能。最近研究证实,CaN信号通路参与了血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖和功能的维持。不同的刺激物(如PDGF2BB、凝血酶和AngⅡ等)可诱导NF-AT传递胞外信号,激活VSMC核内相关基因进行转录,最终刺激VSMC增殖,这一过程可被CaN特异性抑制剂CsA阻断。 环鸟苷酸依赖的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)是广泛的存在于真核细胞内部的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。一氧化氮(nitric oxide, NO)能调节多种信号传导通路,可促进细胞内cGMP合成,然后由cGMP激活PKG进而调节局部和全身信号等。近年来研究CaN与血管钙化中PKG关系的实验有很多,而CaN在钙化的VSMCs胞浆内与PKG I的关系目前国内外尚未见有报道。 本试验采用磷酸二氢钠建立大鼠主动脉VSMCs钙化模型,测定细胞PKG I及CaN mRNA、蛋白质的表达及活性,并观察CaN对PKG I表达的影响,初步探讨CaN及PKG I对血管细胞钙化的调节作用,为血管细胞钙化的临床防治提供新的思路。 方法:大鼠胸大动脉VSMCs传代完成后,将实验细胞随机分为3组。A组:对照组;B组:钙化组;C组:干预组(简称CsA组)。A组给予正常对照的GMDM培养基3ml,B组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的GMDM培养基3ml,C组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的GMDM培养基3ml同时加入浓度为5mg/L的环保霉素A(CsA)30ul,分别培养6天,每3天换液一次,于第6天收集细胞。茜素红染色示钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形,排列紊乱,可见大量褐色钙化点,提示细胞钙化成功。取材后每组用Ellesa法测定大鼠主动脉VSMCs CaN、Ca~(2+)活性,实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA和PKG I mRNA,Western blot测定CaNB及PKG I蛋白定量,采用比色法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;所有数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P0.05即有统计学意义。 结果:(1)茜素红染色结果示对照组大鼠主动脉VSMCs呈梭形,排列整齐,未见钙化点;钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,可见褐色钙化点;CsA组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,也可见大量褐色钙化点。(2)实时荧光定量反转录PCR法结果显示:钙化组与对照组对比:钙化组CaNB mRNA(6.27±1.45)较对照组(1.10±0.28)表达显著增加(P0.01);钙化组PKGⅠmRNA表达(0.26±0.07)较对照组(0.89±0.17)表达显著减少(P0.01);CsA组与对照组对比:CsA组CaNBmRNA(3.38±0.77)较对照组(1.10±0.28)表达显著增加(P0.01);CsA组PKGⅠmRNA(0.60±0.12)较对照组(0.89±0.17)表达显著减少(P0.01);钙化组与CsA组对比:CsA组CaNB mRNA(3.38±0.77)较钙化组(6.27±1.45)表达显著减少(P0.01)。CsA组PKGⅠmRNA(0.60±0.12)较钙化组(0.26±0.07)表达显著增加(P0.01)。(3)Western blot法测定结果显示:钙化组与对照组对比:钙化组CaNB蛋白(69.11±2.51)较对照组(29.9±1.39)表达显著增加(P0.01),PKGⅠ蛋白(0.32±0.01)较对照组(1.54±0.02)表达显著减少(P0.01);CsA组与对照组对比:CsA组CaNB1蛋白(48.22±2.47)较对照组(29.9±1.39)表达显著增加(P0.01),PKGⅠ蛋白(0.77±0.03)较对照组(1.54±0.02)表达也显著减少(P0.01); CsA组与钙化组对比:CsA组CaNB蛋白(48.22±2.47)较钙化组(69.11±2.51)表达显著减少(P0.01),PKGⅠ蛋白(0.77±0.03)较钙化组(0.32±0.01)表达显著增加(P0.01)。(4)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs CaN活性:钙化组(21.47±1.86 IU/L)较对照组(14.31±0.24 IU/L)表达显著增加(P0.01),CsA组(15.34±0.14 IU/L)较对照组(14.31±0.24 IU/L)表达无显著变化(P0.05),CsA组(15.34±0.14 IU/L)较钙化组(21.47±1.86 IU/L)表达显著减少(P0.01)。(5)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs Ca~(2+)含量:钙化组(9.01±0.32 pg/ml)较对照组(6.03±0.33 pg/ml)Ca~(2+)浓度显著增加(P0.01),CsA组(10.39±0.70 pg/ml)较对照组(6.03±0.33 pg/ml)Ca~(2+)浓度显著增加(P0.01),CsA组(10.39±0.70 pg/ml)较钙化组(9.01±0.32 pg/ml)Ca~(2+)浓度显著增加(P0.05)。(6)用比色法测定细胞内ALP活性(U·g-1protein),相对于对照组(38.74±2.23),钙化组的ALP活性(146.04±9.02)显著增高(P0.01),但比CsA组(216.69±14.0)其ALP活性显著降低(P0.01);CsA组(216.69±14.0)较对照组(38.74±2.23)显著增高(P0.01)。 结论:(1)本实验采用磷酸二氢钠成功地建立了大鼠主动脉VSMCs钙化模型。(2)本试验发现大鼠主动脉钙化VSMCs中CaN mRNA、蛋白的表达以及活性明显增加的时候,PKG mRNA、蛋白的表达却出现明显减少,说明在钙化VSMCs中CaN对PKG具有抑制作用。(3)CsA可能促进细胞钙化。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R543

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